金属氧化物纳米颗粒的组织学样品鉴定增强暗场显微镜和高光​​谱遥感制图

动物协议在调查人员的合作机构，州立大学石溪分校获得批准的机构动物护理和使用委员会。具体的材料和用于此造纸设备的列表可以在表1中找到。 组织1.样品制备准备暴露于金属氧化物纳米颗粒以用于组织学或免疫组织化学染色根据先前描述的方法21-23的动物组织。 2.影像初始化显微镜注意：对于该研究中，研究级显微镜下，配备一个高性能的暗视场光源，电动XY载物台控制器，14位深度高光谱照相机，和多个物镜（10X空气，40X空气，100X油浸） 。这里使用的系统具有64纳米的空间分辨率在100X（油​​浸）放大率。用于该螺栓冷凝器y具有两种克勒和临界照明的功能和重点的高准直光的上样倾斜的角度。 插入并打开光源，XY工作台控制器，光学照相机（暗场成像），高光谱相机和计算机系统。设置光源，以75％的电力;提高阶段最大高度;连接导光到冷凝器增强暗场成像，或在显微镜的背面为反射明成像准直仪。 注：光源设置为75％的电力，有整个视野，增强暗淡像素，同时仍然允许枯燥和明亮像素之间的反差之内的所有像素的充分，均匀的照明。 提高冷凝器的工作位置。应用3-5滴A型浸没油对聚光透镜小心，避免任何气泡的形成。擦去油，并重新涂抹，如果气泡应该形成。 放置幻灯片Øn为舞台。慢慢地将冷凝器，直到浸油，使与滑动接触。这将是明显的，通过照明的迅速增白环在油使得与滑动接触。 把10X目标到位。福克斯和检查通过目镜对准冷凝器。 通过粗目标调焦旋钮移动舞台上下，直到亮度最大化。 移动冷凝器集中起来，并通过冷凝器调节旋钮，直至最大亮度被找到。尝试创建中的视场中的亮的中央点的可能。 根据需要调整冷凝器调整旋钮，如果需要到中心亮点。 使用细目标调焦旋钮使亮点成为关注的焦点。当改变目标，以获得不同的放大倍率，调整焦平面。当利用100X目标，应用一滴浸油过的盖玻片，以加强日Ë形象，避免损坏物镜。 捕捉图像使用级控制器找到感兴趣的区域。该区域将被实验的需要来确定。一个典型的指标将与周边地区的高对比度，为泛着金属氧化物纳米颗粒的地区经常出现比没有他们的区域更亮。 使用细客观调焦旋钮，调整所必需的平衡照明的聚光焦点把该地区成为关注的焦点。视野内获得高对比度，良好定义的区域。 确定哪些图像（光学摄像机）或datacubes（用于高光谱摄像机）将被捕获，以及以何种顺序。通常情况下，光学图像与10倍的空中目标，40X空中目标，并100X油浸物镜和相应的恒指datacube用100X油浸物镜获得。 打开光学成像软件。点击“设置 -＃8221;在菜单栏中。选择“图像捕捉按钮捕捉事件”。选择所存储的图像格式（TIFF用于此实验）;指定一个文件名;浏览并选择存储的图像文件夹;保持默认缩时;单击“确定”。 选择创建最高对比度图像中的“曝光”菜单中的曝光设定（对于这项研究中，0.0％的水平，为3.0 dB的增益，和35毫秒的快门被使用）。 通过单击菜单栏中的“图像”按钮捕获图像。通过改变显微镜物镜，为了提供上下文捕获几个低倍率暗场图像除了那些在高放大倍数。 注：在相同的放大倍数为将与超光谱照相机捕获任何datacubes捕捉光学图像，因为这些光学图像倾向于具有来看，更好的美学外观购买目视检查较大的场。重要的是，任何DATACubes稍后将待光谱分析使用一致的放大率，因为它有可能改变目标将改变显微镜光学器件的透射光谱，改变所捕获的光谱，并因此减少了光谱角映射器（SAM）中的精度。如果一个人datacube相比用不同的目标，得到另一datacube，在SAM功能可能无法正常工作。 通过重定向在显微镜的光源旋钮超光谱照相机选择高光谱照相机成像检测器。如果光被引向高光谱照相机，无图像将被显示在光学摄像机软件。最小化，但不要关闭光学成像软件窗口，为一个可能需要按步骤2.4.4规定。 捕获Datacubes 打开收购恒指datacubes的高光谱成像软件。确保导光被引导到高光谱相机。 打开“HYPerspectral显微镜“在菜单栏中选择”恒指显微镜控制“。 设置物镜放大倍数和保存路径。确保命名鲜明所以没有覆盖发生的所有图像和文件。通过调整视图或行（使用720线为这项研究）的数量方面，有更多的时间需要捕获更大的领域显著量更改的区域捕获的设置。最后，设置曝光时间（0.25秒，这项研究）。离开一切为默认，然后单击“预览恒指”查看图像。 注意：显示强度图表显示HSI datacube将被记录在水平轴。纵轴表示将在HSI datacube被捕获的光谱的波长。将光标置于在对应于一个波长的光谱强度曲线的任何位置将导致在图像的所有点的强度，在该波长，被证明。 <l我>焦点在此基础上预览，通过调整细目标重点锐化在这个形象的峰值。如果这是太困难，光学相机的焦距是相当相似，所以加载光学成像软件和滑杆转移到光学照相机，对焦，然后返回到高光谱成像软件和滑动杆返回到高光谱相机。 ，或取消预览调整曝光时间调整在预览通过调节光源亮度，聚光焦点的强度。后者得到最佳的效果，反而增加曝光时间需要更长的图像。这样做的目的是为了更显著峰得足够大，但不超过最大强度为检测器;在这里，理想的范围内16000之间的1000和单位。 点击“捕获”。该显微镜将要求带的暗电流图像。重定向上滑动杆或光圈（小心，以免打扰排列和任何其他光学焦点），并单击“确定”。恢复滑动条或光圈到正确的位置，然后再次单击“确定”形象出现提示时。影像可能需要长达30分钟，但大约5分钟的时间是比较典型的。更长的曝光时间导致更长的成像时间。进度指示器存在。要小心，不要打扰物理范围进度指示器完成之前。 观察四个新的窗口，名称分别为：“可用波段列表”，“＃1zoom”，“＃1scroll”和“＃1 RGB带”。最大化“＃1RGB乐队”的窗口，因为这是datacube的所有引用。 右键单击datacube并将其保存为TIFF，然后单击“确定”。如果完成了成像;收起所有的样品;清洁所有油暴露表面在水中的70％异丙醇;提高阶段最大高度;较低的冷凝器，以最小高度，然后按成非工作位置;关闭向下或拔出光源，工作台控制器，和摄像头。 3.创建参考光谱图书馆选型参考光谱选择已知含有的包含在同一矩阵作为实验样品感兴趣的材料，因为HSI光谱曲线是基质依赖性阳性对照。 在这项研究中，使用猪皮肤注射高剂量的金属氧化物纳米颗粒作为阳性对照用于比较的实验猪皮肤组织从一个局部暴露研究。生成的金属氧化物纳米颗粒在悬浮液中的光谱曲线和检查，发现是不恰当的阳性对照组织学实验样品由于不同的矩阵。 获得来自阳性对照一个datacube如步骤2.4所描述的，使用高光谱相机。 特别谨慎的时候本身拟合的强度，因为这是主度量通过其内部粒子过滤器将标识材料。上面的检测器（在此为16000单位）的饱和点的任何强度将导致无效的数据（参照步骤2.4.5）。 右键单击图像窗口，点击左侧的“Z-轮廓谱”。会出现一个弹出式光谱图的窗口。左键点击到感兴趣的datacube像素，特别是最亮的人，或那些可以自信地确定为代表感兴趣的材料。观察频谱轮廓窗口显示相关的频谱。注意到特别是他们的最低和最高值，其波长对应于它。 当通过点击感兴趣的非常明亮的相对于周围的组织，尤其是那些具有容易识别的颗粒，它们是区域勘测阳性对照样品，调查。这些颗粒是最有可能是脑膜感兴趣IALS，特别是在金属的情况下。 使用下的“颗粒分析”菜单中的“粒子过滤器”工具来确定存在于datacube颗粒。在新弹出的窗口中，应遵守“最高的光谱必须超过”。这将通过观测步骤3.1.3确定。设置此值，因此它比背景像素比感兴趣的材料高，但低。的“有效数据最大”是最大强度（这里，16000单位）。 离开其他参数为默认值，但通过调整“大小阈值”框排除基于大小的物体。保存该数据要么在这一点上，或运行分析后。对于该实验，使用以下参数：光谱最大值必须超过：5000;有效数据最大值为16000;大小阈值（像素）：400。一旦所有参数已经确定，单击“确定”。 观察所得图形以的细节在指定的强度阈值检测颗粒;这个数据可以导出。如果感兴趣的材料的特性最大反射率波长是已知的，选择那些有类似的“最大WL”值的颗粒;否则，单击“全选”。然后单击“导出”; “光谱库”。选择一个文件名，然后单击“确定”。 取出假阳性谱选择，将作为阴性对照的样品。这样的样品应已制备并以相同的方式处理所有的实验样品保存，由于没有纳米颗粒类似或相同的所关心的材料的有保证。 注意：重​​要的是，与阴性对照的矩阵是相同的实验样品的基质，如HSI光谱曲线是基质依赖性。在这项研究中，我们使用猪皮肤不暴露在金属氧化物纳米材料为负控制。 如在步骤2.4.7所述，使用高光谱相机获取从阴性对照几个datacubes。中的至少一个是必需的，但更可以被捕获，以增加选择性（这是在事件尤其重要的是，某些污染物可能在参考光谱）。 使用该高光谱成像软件来过滤收集在步骤3.1（阳性对照）针对每个datacube的光谱库在步骤捕获3.2.2（阴性对照）串联的指示，在下面的步骤： 注：保存所得，过滤光谱库到一个单独的文件，并作为用于感兴趣的材料的参考光谱库使用。 点击“过滤谱库”下的分析菜单，在主编程工具栏上。点击“打开”; “新建文件”，并选择在步骤3.1创建的光谱库。为阳性对照作为输入文件。点击“确定”。 要使电子邮件xternal源，选择在光谱数据中的“形象”。保留下的工艺参数对话框的默认设置。选择一个输出名称对于筛选库（这应该是比原来的不同，或收集的原始光谱库将丢失）。点击“确定”。 点击“打开”; “新建文件”，然后选择为阴性对照，出现提示时选择源图像的步骤3.2.2捕获的第一datacube。 注：该软件将分析光谱库，并删除每个光谱相匹配的阴性对照datacube的任何频谱。删除从选择标准的背景，从而减少潜在的假阳性。的摘要，将可用这样做时（注意，此概述并不自动保存）。 如果额外的过滤需要，从步骤3.2.3.1重复，除非：3.2.3.2步，选择创建的最后一个过滤谱库（导致步骤3.2.3.3后联合。mpletes）;在步骤3.2.3.3，请从步骤3.2.2下一datacube。 注：校正和正火对于灯频谱可能是必要的，如果样本散射相当量的光（例如，碳纳米管）和/或如果当针对阴性对照过滤阳性对照光谱库零谱仍然存在。并没有出现我们研究这些情况，因此没有进行这种修正。 4.图像分析光谱角制图打开来自谱菜单，映射方法的子菜单的“光谱角映射器”（SAM），利用超光谱成像软件一旦所有的实验datacubes已经获得以下步骤2.4。光谱角映射器通过几何分析变化强度作为波长的函数的光谱进行比较（即，它通过正常化它们的强度和比较所述角度重新比较两个谱quired追踪每个光谱的曲线图）24。 随着datacube打开时，选择实验datacube在弹出窗口的名称，然后单击“确定”。如果没有文件名列出，单击“打开”; “新文件”，选择实验datacube，然后单击“确定”。 观察称为端元收集新的弹出窗口：SAM。点击“导入”，在菜单栏，然后​​选择“从光谱库文件”中选择。一个弹出窗口命名谱库输入文件将会出现。打开那在步骤3.2.3创建的参考谱库。并单击“确定”。注意命名为“输入谱库”的新的弹出窗口。 点击“选择所有项目”;单击“确定”右键点击“颜色”，然后选择“应用默认颜色为所有”。单击“全选”，其次是“应用”，然后选择输出文件名称的d单击“确定”。该光谱角映射器将需要几秒钟来分析和保存数据。 在打开的高光谱成像软件datacube。在图像窗口的叠加菜单中选择“分类”，然后定位到该文件名，然后单击“确定”。用户现在可以覆盖任何频谱从库看到他们映射到图像中。 如果一个统一的配色方案需要，如其他软件更容易分析（如步骤4.2节选择在“交互类的工具”，通过在图像窗口的叠加菜单中打开，在选项菜单中的“合并类”选项）。 突出显示所有的分类组合（通常，在一切，除了“机密”，“类合并成基地”的列表），然后从“基类”列表中的单个频谱，然后单击“确定”。该颜色将立即repres耳鼻喉科所有选中的光谱。 点击所选择的颜色和所有匹配的频谱将在该颜色显示。 为了获得二色图像，将显示在黑色背景上，cIick的“未分类”的色彩中，这是黑默认匹配光谱。观察二色的图像。这个步骤可以通过在“未归类”颜色盒再次单击颠倒。 右键点击将图像保存为TIFF，包括任何覆盖当前活动。 注：对于未来的成像处理中，二色图像将被使用。 从选项菜单中选择“级分配”中的“互动类工具”窗口来获取映射统计数据。这个数据代表了很多像素是如何映射的（未分类），有多少被确定为感兴趣的材料。注意，像素的数量不具有映射颗粒的数量相对应。这个信息是不会自动řecorded。 在高光谱粒子分析图图像打开在NIH ImageJ的软件图像。 使用图像菜单，调整子菜单，“阈值”的功能。选择区分的所有其他材料感兴趣粒子参数。使用下面的阈值参数研究：默认情况下阈值法，色红，色彩空间HSB，检查深色背景复选框，选中通复选框色调，饱和度和亮度。 注意：这可能从案件情况显著改变。当分析映射datacube，这可以通过统一的所有相关类单一颜色和覆盖所有非保密颜色彩色产生图像（步骤4.1.4至4.1.8）之前被简化。 使用分析菜单，“分析粒子”功能，这将检索的信息区域，意思是，最低和最高值。在这项研究中，使用此参数：尺寸0无穷远，圆0-1，什么都不显示，检查显示效果复选框。 进行统计分析，此数据输出到另一个软件程序实现与位于类似对照样品中颗粒的数量和大小的统计比较。我们建议使用电子表格的ImageJ的数据分析。 4.2.4步后显示在结果表中的数据复制到电子表格。 MAX函数可用于在第一（无）柱来确定颗粒的数目，而平均函数可用于在区列，以确定粒子的平均尺寸。在未来，实验验证将继续执行在确定平均大小的已确立的标准尺寸（例如，TEM）调查此功能。