초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법
Summary
We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.
Abstract
초기 마우스 배아의 조작과 문화는 강력하면서도 크게 과소 활용이 모델 시스템의 가치를 향상시키는 기술이다. 반대로, 세포 배양 널리 발생 생물학 연구에서 사용되어왔다. 그러나, 시험 관내 배양 된 세포는 진정 생체 세포 종류를 대표 여부를 결정하는 것이 중요하다. 개발하는 동안 그들의 기여 평가 하였다 배아에 세포를 이식하는 체외 배양 된 세포의 잠재력을 결정하는 유용한 방법이다. 본 연구는 생체 외 배양 하였다 이른 postimplantation 마우스 배아의 정의 부위에 세포를 이식하는 방법을 설명한다. 또한 높은 형질 전환 효율과 낮은 세포 사멸 모두 외인성 DNA를 수신하는 셀의 수의 정확한 정위 및 조정을 허용 공지 직경 유리 모세관을 사용하여 최적화 된 전기 천공 방법을 소개한다. 모든 SP를 필요로하지 않는 이러한 기술,ecialized 장비, 낭 배기 초기 기관 형성 단계 마우스 배아 수의 실험 조작, 배양 세포의 소집단의 헌신과 세포 분화에 현장에서 유전자 조작의 효과의 수 분석을 렌더링합니다.
Introduction
세포 배양에 널리 발생 생물학 연구에서 사용되어왔다. 마우스 배아 줄기 세포 (는 ESC)와 epiblast 줄기 세포 (EpiSCs)는 체외에서 세 가지 배엽으로 분화 초기 포유 동물의 배아에서 세포 분화에 유용한 모델입니다 수 있습니다. 이러한 세포 라인의 유도는 체외 조작 및 초기 배아 패턴 동안 운영 지역화 신호 이벤트 및 전사 네트워크의 자세한 조사를 위해 기회를 열었습니다. 그러나, 배양에서 수행되는 조작의 생체 적합성을 결정하는 데 중요한 남아있다. 착상 전 배아 유래 마우스는 ESC의 생체 전위는 착상 전 배아 (morulae 또는 배반포) (1)에 다시 도입하여 평가하고있다. 그러나 postimplantation 배아의 epiblast 세포를 나타냅니다 EpiSCs는 착상 전 배아 2,3에 효율적으로 통합 할 수 없습니다. 우리 previo우리의 연구 결과는 postimplantation 배아 4에 이식 할 때 EpiSCs 효율적으로, 키메라를 생성하고 모든 배엽에 기여할 수있는 것으로 나타났습니다. 따라서, 생체 외 배양 된 세포를 평가하는 가장 좋은 방법은 생체 내에서 해당 환경으로 도입하는 것이다.
전기는 생체 내 및 생체 외 실험 모두에서 표적 세포에 외래 분자를 제공하기 위해 널리 사용되는 방법이다. 전기 에너지는 외인성 디옥시리보 핵산 (DNA) 또는 세포를 입력하는 리보 핵산 (RNA)를 허용 세포막에 다수의 구멍을 생성 할 수있다. 이 기술의 가장 큰 과제 중 하나는 높은 electrotransfection 효율 5,6 최적의 세포 생존 능력을 결합하는 것입니다. 배아 조직에서의 핵산의 전기 천공을 위해, 금 넓은 공간 범위 7-9의 셀 타겟팅 있도록 전극이 가장 일반적으로 사용되어왔다 도금. 더 LOCA를 달성하기 위해유전자 전달하게 안정적는 침상 전극은 전계 10,11 초점을 달성하기 위해 이용되었다. 이 방법을 사용하여, 저자는 일렉트로 후 약 30-60 세포 (11)를 구성하는 DNA를 흡수 한 것으로 나타났다. 그럼에도 불구하고, 정확 일렉트로 세포의 수를 조정하는 고정 폭 전극과 유지 어려운 것으로 보인다. 모세관 전기 기술은 단일 세포에 플라스미드 12-14를 전달하는데 사용되어왔다. 그러나,이 기술은 생체를 배아 플라스미드 electroporating 적용되지 않았다. 최근 마이크로 디바이스는 초기 postimplantation 마우스 배아 15 로컬 electroporate 몇 말단 내장 내배엽 세포 (이하 4 셀)로보고되었다. 그러나,이 장치가 효율적으로 타겟팅 외배엽과 중배엽 생체 수 있는지 아직 알려져 있지 않다.
이 연구에서 우리는 초기 게시물에 세포 및 유전자 기능을 평가하는 두 가지 새로운 방법을 설명-implantation 배아. 우리는 먼저 자신의 생체 내 잠재력을 평가하기 위해 초기 마우스 배아에서 정의 된 사이트에 체외 배양 된 세포를 이식하는 방법을 보여줍니다. 이식 세포와 그 후손의 통합이 모든 유전 태그 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP)에 의해 표시, 추가로 조직 특이 적 단백질의 면역 염색으로 검사 할 수있다 (4). 둘째, 우리는 정확하게 DNA를 제공하는 개선 된 방법을 설명 오히려 침상 전극을 사용하는 대신 전기를 통한 배아 국부 사이트. 우리는 뾰족한 유리 모세관 안에 세선을 삽입하고, 이러한 변형은 높은 효율과 제한과 셀의 소수의 DNA를 제공 할 수 있음을 입증 세포 죽음. 또한, 우리는 상이한 개구 크기를 갖는 유리 모세관을 이용하여, 우리는 일렉트로 세포의 수를 제어 할 수 있음을 보여준다. 따라서, 우리는 O이 방법은 적은 수를 포함하는 초기 배아 패턴을 연구하기 위해 아주 유용하게 사용될 수 있다고 생각F 세포.
Protocol
Representative Results
Discussion
접목
세포 이식 실험에서 중요한 단계 덩어리의 분열을 방지하기 위해, 이상적으로는 하나의 동작의 셀 간섭 문자열의 삽입이다. 이 기술은 입 피펫을 조절하는 연습이 필요합니다. 공여 세포는 숙주에서 잘 통합하면, 이들의 유도체는 배아에 분산시키는 것이다. 상기 분산 도너 유래 세포는 숙주에서 적절히 분화 여부를 확인하기 위해, 면역 염색은 배아 부에서 수행 될 수있다. 공여 세포는 숙주 환경과 호환되지 않을 경우, 이들은 어느 검출 (이들이 배아로부터 토출되는 바와 같이) 또는 배양 후에 배아 비법 덩어리를 형성 할 수 없다. 분산 된 세포 및 세포 덩어리가 모두 관찰 된 경우, 이는 너무 많은 세포가 그래프트 된 나타낼 수 있고, 주변의 숙주 세포와 상호 작용할 수없는 과도한 공여 세포는 덩어리 형성을 초래. 이 경우, 추가로 함유 그라프셀들의 작은 수를 행할 수있다.
세포 이식 기술의 주요 한계는 48 시간 이상이 달성되어 있지 않은 기간 동안 마우스의 생체 외 배양 세포를 사람의 전체 생체 전위를 결정하는 것이 가능하지 않다는 것이다. 초음파 유도 세포 주입과 결합 된 경우, 이는 자궁 내 태아에 배양 된 세포를 전달하는 것이 가능할 수있다. 세포 이식 실험이 광범위하게 우리 그룹에 사용 된 우리에게 다양한 세포 유형 4,21,22의 생체 가능성에 대한 중요한 단서를 제공 한 요약. 그것은 초기 postimplantation 배아에서 체외 배양 된 세포의 생체 내 잠재력을 평가하는 일반적인 유틸리티의 기술이다.
전기
이 연구에서 우리는 단지 표시했지만 그것은 내가, epiblast을 대상으로 모세관 전기 기술을 사용하는 것이 효율적이다t는 의도적으로 이러한 내배엽 세포와 같은 다른 배엽을 대상으로하는 것도 가능하다. 모세관 전기 천공 법을위한 중요한 단계는 초기 PBS 마우스 배아에 매우 차선 때문에 각각의 태아 (태아 당 <5 분) electroporate하는 데 걸리는 시간을 최소화하는 것이다. 우리의 데이터는 위의 배아에서 대부분의 지역에서 전기가 배아의 성장에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 그러나, 노드에 전기가 이상 발생시 원인 및 배아의 조기 사망을했다. 이는 중요한 시그널링 센터 (23)를 형성하는 세포의 손상 또는 사망 가능성이 높다. 따라서,이 영역은이 기술 회피되어야 할 것이다. 또주의해야 할 점은 결과 섹션에서 언급 한 바와 같이 epiblast 또는 원시 행진 세포를 대상으로 한 반면, 일부 내배엽 세포는 또한 전기 천공 된 점이다. DNA는 epiblast 상피 아래 간극을 통해 내배엽에 도달 때문일 수있다. 내배엽은 상피 세포의 구성과 일 우리의 경험에ESE 세포는 DNA를 차지하기 위해 더 높은 경향이있다. 운명 매핑에이 기술을 적용 할 때 따라서, 그것은 처음에 DNA를 가지고있는 세포를 평가하는 것이 중요하다.
GFP 플라스미드 효율적이 연구에 도시 된 전기 매개 변수를 사용하여 전달 될 수 있고, 다른 DNA 구조체의 효율이 변할 개별 최적화를 필요로 할 수있다 : 또한 pCAG-GFP 및 pCAG-Cre 호텔이 있지만 주목해야한다. 플라스미드 형질 어려운 것으로 발견되면 DNA 농도, 전기 전압 또는 펄스의 수의 변화는 이루어질 수있다.
제한된 세포 사멸과 배아에서 거의 세포에 GFP 플라스미드 : 요약하면, 우리의 최적화 된 모세관 전기 시스템은 효율적이고 재현성 GFP 또는 Cre 호텔을 제공 할 수 있습니다. 이 방법은 고가의 또는 고도의 전문 장비를 필요로하지 않기 때문에, 셀 추적 연구 또는 이소성 발현 또는 조건부 삭제 (O)의 효과를 시험에 아주 유용하게 사용될 수있다초기 배아에서 F 유전자는 경우 전기는 floxed 조건부 돌연변이 대립 유전자를 운반하는 배아에서 수행된다. 따라서,이 기술은 전기 천공 지역화 야생형 배아 환경의 컨텍스트에서 셀별로 셀 고유 인자의 역할을 이해하는데 유용한 기능성 도구를 제공한다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council
Materials
| Forceps | Dumostar | T5390 | |
| Dissecting stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Stereomicroscope system with fluorescence | Nikon | AZ100 | |
| Inverted microscope with a digital camera | Olympus | Olympus BX61 | |
| Inverted confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | |
| Low melting point agarose | Life Technologies | 16520-050 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 11397863 | |
| 30mm Petri dishes | Fisher Scientific | 121V | |
| 4-well plates | Thermo scientific | 179820 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Pipettes | NICHIRYO | Nichipet | |
| tips | Greiner Bio One | 685280 | |
| Cell culture incubator | SANYO | MCO-17AIC | |
| Roller culture apparatus | BTC Engineering | ||
| Syringe filters 0.45µm, sterile | Sigma-Aldrich | 10462100 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | SH30549.01 | |
| Sodium pyruvate solution | Fisher Scientific | SH30239.01 | |
| Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml | Lonza | DE17-602E | |
| Gas Cartridge for Portable Meker Burner | COLEMAN | COLEMAN 250 | |
| Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm | Harvard Apparatus | 640798 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Microforge | De Fonbrune | BS030301 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV830 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
| ECM 830 square wave pulse generator | BTX | 45-0002 | |
| Green food coloring dye | Sigma-Aldrich | C.I. 42053 | |
| A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye | Biotium | 40060-T | |
| pCAG-Cre:GFP | Addgene | #13776 | |
| pCAG-GFP | Addgene | #16664 | |
| Multimeter | Excel | XL830L | |
| Micromanipulators | Leitz | ||
| 0.2mm diameter platinum wire | Agar Scientific | E404-2 | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | |
| Goat anti-Chicken IgY, HRP | Santa Cruz | sc-2428 | |
| Liquid DAB+ Substrate Chromogen System | Dako | K3467 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D21490 | |
| A far-red fluorescence nuclear counterstain | Life Technologies | T3605 |
References
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