We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.
Manipolazione e la cultura di embrioni precoci di topo è un potente ma in gran parte sottoutilizzato tecnologia aumentando il valore di questo sistema modello. Viceversa, coltura cellulare è stato ampiamente utilizzato in studi di biologia dello sviluppo. Tuttavia, è importante determinare se le cellule coltivate in vitro rappresentano veramente de tipi di cellule in vivo. Innesto cellule in embrioni, seguito da una valutazione del loro contributo durante lo sviluppo è un metodo utile per determinare il potenziale di cellule coltivate in vitro. In questo studio, si descrive un metodo per cellule innesto in un sito definito di embrioni di topo presto dopo l'impianto, seguita da coltura ex vivo. Introduciamo anche un metodo di elettroporazione ottimizzato che utilizza capillari di vetro di diametro noto, permettendo precisa localizzazione e regolazione del numero di cellule che ricevono DNA esogeno sia con alta efficienza di trasfezione e morte cellulare bassa. Queste tecniche, che non richiedono spattrezzature ecialized, rendono le manipolazioni sperimentali del gastrulazione e il mouse embrione precoce possibile organogenesi fase, permettendo analisi di impegno in sottopopolazioni di cellule in coltura e l'effetto di manipolazioni genetiche in situ sulla differenziazione delle cellule.
Colture cellulari è stato ampiamente utilizzato in studi di biologia dello sviluppo. Le cellule staminali embrionali di topo (CES) e le cellule staminali epiblasto (EpiSCs) possono differenziarsi in tutti e tre i foglietti embrionali in vitro e sono un modello utile per la differenziazione delle cellule ai primi di embriogenesi dei mammiferi. La derivazione di queste linee cellulari ha aperto la possibilità per la manipolazione in vitro e investigazione dettagliata degli eventi localizzati di segnalazione e le reti trascrizionali che operano durante la prima patterning embrionale. Resta però importante determinare la rilevanza in vivo di eventuali manipolazioni eseguite in coltura. Il potenziale in vivo di preimpianto ottenute dagli embrioni di topo CES è stata valutata con l'introduzione di nuovo in embrioni preimpianto (morule o blastocisti) 1. Tuttavia, EpiSCs che rappresentano le cellule in embrioni postimpianto epiblasto non possono integrare in modo efficiente in embrioni preimpianto 2,3. Il nostro previonoi scoperte hanno dimostrato che EpiSCs può efficacemente generare chimere e contribuire a tutti i foglietti embrionali, quando innestati in embrioni postimpianto 4. Così, il modo migliore per valutare le cellule coltivate in vitro è di introdurli al loro ambiente corrispondente in vivo.
L'elettroporazione è un metodo ampiamente utilizzato per trasportare molecole esogene in cellule bersaglio sia de vivo che in vitro. L'energia elettrica può generare un gran numero di pori nella membrana cellulare, che consente l'acido esogeno desossiribonucleico (DNA) o acido ribonucleico (RNA) per entrare nelle cellule. Una delle maggiori sfide per questa tecnica è quello di combinare la vitalità cellulare ottimale con alta efficienza electrotransfection 5,6. Per elettroporazione di acidi nucleici nei tessuti embrionali, placcati oro sono stati più comunemente usato elettrodi, permettendo il targeting di cellule in una vasta gamma spaziale 7-9. Per ottenere una più locatrasferimento genico zato, un elettrodo a forma di ago è stato utilizzato per ottenere un campo elettrico focale 10,11. Utilizzando questo metodo, gli autori hanno dimostrato che dopo l'elettroporazione, circa 30-60 cellule avevano preso il DNA costruire 11. Tuttavia, sembra che regolando con precisione il numero di cellule elettroporate rimane difficile con un elettrodo a larghezza fissa. La tecnica capillare elettroporazione è stata utilizzata per fornire plasmidi di singole cellule 12-14. Tuttavia, questa tecnica non è stata applicata per electroporating plasmidi agli embrioni ex vivo. Più di recente, un microdispositivi è stato segnalato a livello locale electroporate poche cellule distali viscerali endoderma (meno di 4 celle) all'inizio postimpianto embrioni di topo 15. Tuttavia, non è ancora noto se questo dispositivo può efficacemente bersaglio ectoderma e mesoderma ex vivo.
In questo studio descriviamo due nuovi metodi per valutare la funzione cellulare e genica nei primi mesi dopo-implantation embrioni. Per prima cosa dimostrare come innestare cellule coltivate in vitro in siti definiti negli embrioni precoci di topo per valutare il loro potenziale in vivo. L'integrazione delle cellule innestate e loro discendenti, tutti etichettati da un tag genetica (ad esempio, una proteina fluorescente verde (GFP), può essere ulteriormente esaminata mediante immunocolorazione di proteine specifiche del tessuto 4. In secondo luogo, si descrive un metodo migliorato per fornire precisione DNA siti localizzati nell'embrione tramite elettroporazione. Invece di utilizzare un elettrodo a forma di ago, abbiamo inserito un filo sottile all'interno di una punta fine capillare di vetro, e dimostrare che tale modifica può fornire DNA per un piccolo numero di cellule con alta efficienza e limitato cella della morte. Inoltre, abbiamo dimostrato che, utilizzando capillari di vetro di diverse dimensioni di apertura, possiamo controllare il numero di cellule elettroporate. Pertanto, crediamo che questo metodo può essere di grande utilità per studiare presto patterning embrionale coinvolgendo piccoli numeri ocellule f.
Innesto
Il passaggio critico per gli esperimenti di innesto delle cellule è l'inserimento di una stringa di celle coerente idealmente in una singola azione, per evitare rottura del ciuffo. Questa tecnica richiede una certa pratica nel controllo pipetta bocca. Se le cellule del donatore incorporano bene nell'ospite, loro derivati si disperderanno nell'embrione. Per determinare ulteriormente se le cellule derivate donatore disperso differenziano opportunamente nell'ospite, immunocolorazione può essere eseguita su sezioni di embrioni. Se le cellule del donatore non sono compatibili con l'ambiente host, essi o non possono essere rilevati (come vengono espulsi dal embrione) o formano grumi non costituite in società gli embrioni dopo la cultura. Se sono state osservate sia le cellule disperse e grumi di cellule, questo può indicare che le troppe cellule sono stati innestati e cellule del donatore eccessivi che non possono interagire con le cellule ospiti circostanti provocato la formazione di gruppo. In questo caso, innesti aggiuntivi contenentiun minor numero di cellule può essere eseguita.
La maggiore limitazione della tecnica dell'innesto cellulare è che non è possibile determinare il potenziale pieno in vivo di cellule da topo ex vivo cultura su periodi di oltre 48 ore non è stata raggiunta. Tuttavia, se combinato con iniezione di cellule ecografico, può essere possibile trasferire cellule coltivate per gli embrioni in utero. Per riassumere, esperimenti sulle cellule innesti sono stati ampiamente utilizzati nel nostro gruppo e ci hanno dato preziosi indizi circa il potenziale in vivo di vari tipi cellulari 4,21,22. Si tratta di una tecnica di utilità generale per valutare il potenziale in vivo di cellule coltivate in vitro in embrioni precoci postimpianto.
Elettroporazione
Sebbene in questo studio abbiamo dimostrato solo che è efficiente utilizzare la tecnica capillare elettroporazione di indirizzare il epiblast, it è anche possibile indirizzare intenzionalmente altri strati germinali come cellule endoderma. Il passaggio critico per la tecnica capillare elettroporazione è ridurre al minimo il tempo impiegato per l'elettroporazione ogni embrione (<5 min per embrione) dal PBS è molto ottimale per gli embrioni precoci mouse. I nostri dati sopra ha dimostrato che, nella maggior parte delle aree nei embrioni, elettroporazione non influenza la crescita dell'embrione. Tuttavia, elettroporazione nel nodo causato anomalie dello sviluppo e ha portato alla morte prematura dell'embrione. Ciò è probabilmente dovuto a danni o la morte delle cellule che formano i centri di segnalazione importanti 23. Quindi, questa regione dovrebbe essere evitato con questa tecnica. Un ulteriore avvertimento è che, come indicato nella sezione dei risultati, mentre epiblasto o cellule stria primitiva stati presi di mira, alcune cellule endoderma sono stati elettroporate. Ciò può essere dovuto il DNA raggiunge il endoderma attraverso le lacune sotto l'epitelio epiblasto. Endoderma si compone di cellule epiteliali e nella nostra esperienza thESE cellule hanno una maggiore propensione a prendere il DNA. Pertanto, quando si applica questa tecnica per mappatura destino, è importante valutare quali cellule inizialmente occupano DNA.
Va inoltre notato che, sebbene pCAG-GFP e pCAG-Cre: plasmidi GFP possono essere forniti in modo efficiente utilizzando i parametri di elettroporazione mostrati in questo studio, l'efficacia di altri costrutti di DNA può variare e devono ottimizzazione individuale. Alterazioni concentrazione di DNA, tensione elettroporazione o il numero di impulsi possono essere effettuate se plasmidi risultano difficili da trasfettare.
In sintesi, il nostro sistema di elettroporazione capillare ottimizzato in modo efficiente e riproducibile consegnare GFP o Cre: plasmidi GFP in poche cellule in un embrione con la morte delle cellule limitato. Poiché questo metodo non richiede costose attrezzature o altamente specializzate, può essere di grande utilità per gli studi di monitoraggio cella o nel testare l'effetto dell'espressione ectopica o condizionale eliminazione of geni in embrioni precoci, se elettroporazione viene eseguita in embrioni aventi floxed alleli mutanti condizionali. Pertanto, questa tecnica elettroporazione fornisce uno strumento funzionale utile per comprendere su base cella per cella i ruoli di fattori cellulari intrinseca nel contesto di tipo selvatico localizzata ambienti embrionali.
The authors have nothing to disclose.
We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council
Forceps | Dumostar | T5390 | |
Dissecting stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Stereomicroscope system with fluorescence | Nikon | AZ100 | |
Inverted microscope with a digital camera | Olympus | Olympus BX61 | |
Inverted confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | |
Low melting point agarose | Life Technologies | 16520-050 | |
Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 11397863 | |
30mm Petri dishes | Fisher Scientific | 121V | |
4-well plates | Thermo scientific | 179820 | |
M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Pipettes | NICHIRYO | Nichipet | |
tips | Greiner Bio One | 685280 | |
Cell culture incubator | SANYO | MCO-17AIC | |
Roller culture apparatus | BTC Engineering | ||
Syringe filters 0.45µm, sterile | Sigma-Aldrich | 10462100 | |
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154 | |
non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
L-glutamine | Fisher Scientific | SH30549.01 | |
Sodium pyruvate solution | Fisher Scientific | SH30239.01 | |
Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml | Lonza | DE17-602E | |
Gas Cartridge for Portable Meker Burner | COLEMAN | COLEMAN 250 | |
Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm | Harvard Apparatus | 640798 | |
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
Microforge | De Fonbrune | BS030301 | |
Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV830 | |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
ECM 830 square wave pulse generator | BTX | 45-0002 | |
Green food coloring dye | Sigma-Aldrich | C.I. 42053 | |
A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye | Biotium | 40060-T | |
pCAG-Cre:GFP | Addgene | #13776 | |
pCAG-GFP | Addgene | #16664 | |
Multimeter | Excel | XL830L | |
Micromanipulators | Leitz | ||
0.2mm diameter platinum wire | Agar Scientific | E404-2 | |
Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | |
Goat anti-Chicken IgY, HRP | Santa Cruz | sc-2428 | |
Liquid DAB+ Substrate Chromogen System | Dako | K3467 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D21490 | |
A far-red fluorescence nuclear counterstain | Life Technologies | T3605 |