運動の時空間マッピングで<em>エクスビボ</em腸の>準備

バージニアコモンウェルス大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）は、このプロトコルで使用されるすべての動物や安楽死の手順を承認しました。 ソリューションの調製 （：118のNaCl、4.75のKCl、1.19 KH 2 PO 4、1.2 硫酸マグネシウム、2.54のCaCl 2、25のNaHCO 3、11グルコース[mMの中]で構成）クレブス緩衝液4リットルを準備します。 、各固体化学物質の適切な量を計量し、脱イオン水の適切な量に入れ、溶液が透明になるまでボルテックスを用いて混ぜます。 37℃に加熱しながら、30分間carboxygenの溶液（95％O 2、5％CO 2）を通気。 HClを用いて、必要に応じて、37℃（器官槽と同じ温度）でpHを7.4に調整しながら、溶液のpHを決定します。実験期間を通してクレブス緩衝液を連続的carboxygenated、37℃で保管してください。 入れバッファ容器への蠕動ポンプからの流入と流出管とチューブとオルガンバスシステム全体のバッファの灌流を開始するために蠕動ポンプをオンにします。 注：バッファが最初に潅流バッファに器官浴や化学物質へのいずれかの組織の追加まで、元の容器に戻し圧送することができます。これは、実験のために必要なバッファの総量を減らすことができます。入って来ると発信バッファが混在しないように、そして、発信バッファ灌流ラインが空の容器の中に配置する必要があります。 器官浴内のバッファになり、実験の期間中、37.0±0.5°Cのままであるように風呂サーキュレータに加熱システムの温度を調整します。確認し、必要に応じて、少なくとももう1つの時間ステップ2.8で浴に組織セグメントを配置する前に、クレブス緩衝液のpHを変更します。 組織の調製安楽死させます密閉されたチャンバー内の二酸化炭素吸入/窒息またはローカル動物のケアと使用委員会によって承認された別の安楽死法を用いてモルモット。 動物の安楽死を確認した後、解剖ハサミで縦方向に腹壁を開き、腸を探しカット。盲腸を露出させる助けるために小腸に添付腸間膜をカットします。 注：動物のケアと使用委員会によって承認された安楽死を確認するためには、二国間の開胸術などの二次の手順を実行します。 盲腸の先端を見つけ、盲腸との接続にちょうど遠位近位結腸を横断。そして、最初の切断に近接結腸再び~8センチ先端を横断。 さらに解剖のために（セクション1に記載）温め、carboxygenatedクレブス液に結腸組織を置きます。解剖浴にコロンをピンとできるだけ多くの腸間膜脂肪を除去するために、はさみの小さいセットを使用します。 時間でeated解剖トレイ、平滑末端のカテーテルに連結された注射器を用いて内腔を通ってクレブス緩衝液の優しく灌流により、すべての管腔内コンテンツを削除する（組織の穿孔を防ぐため）。この灌流プロセス中にセグメントの過膨張は避けてください。 2火災研磨ガラス管のカテーテル（3 mmの直径）を入手し、組織内腔に入るガラス管の部分の周りにポリエチレンチューブの短い断片（〜3 mmの長さと〜3 mmの直径）を配置します。 注：これは、縫合糸は安全なままに組織し、ガラス管の周りに配置され、準備が臓器浴にし、組織の長さの変化の間に置かれているように滑らないことを可能にします。 組織標本の経口最後に1つのカテーテルを挿入し、外科医の結び目を使用してカテーテルを囲むチューブの小片を中心に縫合糸を結びます。ゆっくり結び目がぴったりであることを確認するために戻って出てカテーテルを引くしようとします。その後、他のカテーテル入るトンで同じアクションを実行します彼は、組織の終わりを尾方。 カテーテルが固定されると、器官槽のいずれかに解剖トレイから製剤全体（組織プラスカテーテル）を移動。ユーザから離れて直面している経口端に浴に準備を置きます。 次に2を示唆のいずれかの方法で器官槽にガラス管のカテーテルを固定/マウント。 注：ガラス管は実験中に長さを変更したり、浴中のクレブス緩衝液の表面レベルの上に来てからの組織セグメントを防ぐセキュリティ保護。 オプションA：成形機の粘土やプラスチックのクリップを使用することによりプラスチック臓器槽の側面の上部にガラス管の上部を固定します。 オプションB：プラスチッククリップを使用することにより、臓器浴剤の上にカメラを保持する金属極にガラス管を固定します。 カテーテルは風呂に固定されると、各カテーテルの開放端にチューブの5 cmの作品を添付します。経口猫のためのheterは、近位結腸セグメントの内腔にバッファを注入するために使用される10-mlシリンジ、このチューブを取り付けます。尾方カテーテルは、チューブのこの作品は、管腔の流出が回収容器（50ミリリットルのビーカー、貯水池など ）に向けられるようになります。 経口端部に取り付けられた注射器を使用して、ゆっくりとフラッシュは、組織を通って流れることができる液体を確実にするために、組織内腔を通してクレブス緩衝液を加温しました。フローは、尾方カテーテルから出る液体によって確認されます。組織を30分間平衡化しながら、録画システム（プロトコルセクション3）を調整します。 ビデオ記録システムの3キャリブレーション明るさとコントラスト、およびソフトウェアを使用して水平方向の距離をカメラの高さの配置、ビデオ設定を較正します。 注：腔内灌流のセットアップに最適な設定は、ペレット推進13の速度を決定するために使用される設定とは異なります。 CLIカメラのための実験のタブのCKを校正​​します。そして、「ファイル」メニューの「キャリブレーションを]をクリックします。 ビデオは「キャリブレーションワークステーションのウィンドウに表示されたら、画像が結腸内腔に挿入されたカテーテルの先端を含んでいる高さにカメラを設定します。 次に、それぞれのバスに接続されている半透明の定規ステッカーを使用して、画像で見て水平方向の距離を調整します。 注：このキャリブレーションは、管腔直径と収縮波の速度の後のソフトウェアの計算に不可欠です。 彼らはカメラ画像における支配者によると10ミリメートル離れているように、同じ「校正ワークステーションのウィンドウで、赤い垂直のガイドラインを設定します。次に、「距離カーソル」ウィンドウに適切な距離（10ミリメートル）を入力し、「CAL」ボタンをクリックします。 次に、利得、明るさ、およびそのようにカメラ画像を変更するために「較正ワークステーション」ウィンドウ内でスライダをシャッターを調整します組織セグメントは、明るい背景に暗いシルエットとして表示されます。 メモ ：図4は、このキャリブレーション手順の良い面と悪い例を示します。 画像を適切に調整するには、また、カメラ自体にフォーカスや絞りのつまみを調整します。 キャリブレーションが完了しました。 [保存]をクリックし、ポップアップで「OK」をクリックし、最後に「終了」ボタンをクリックします。 4.一般的な実験手順カメラキャリブレーション手順と組織の平衡の30分が完了した後、各実験プロトコルで裁判に名前を付けます。トライアル名を名前と化合物と液体の体積の濃度に基づいてすることができる管腔内実験の部分の間に組織セグメントに灌流されます。 その後、チューブのクランプを使用することにより尾方カテーテルから突出したチューブを閉塞。 注：これは、府中尾方端から出るの管腔内の液体を防ぎますrther実験、膨満の様々なレベルを誘発するためにルーメン内の特定のボリュームの使用を可能にする（ 図1）。 モルモットex vivoでの準備の推進収縮を開始するのに十分な膨張を提供するために、近位結腸内腔に約0.7ミリリットルクレブス緩衝液のを注入。 注： – 無傷のセグメントおよび器官槽内のセグメントに適用されるストレッチの量の全体の長さに応じて（0.2ミリリットル0.1）このボリュームは若干異なる場合があります。 セグメントは管腔の流体によって膨張されると、カメラの電源をオンにして、時間の予め決められた期間（ 例えば、10分）のための運動を記録します。 具体的には、実験的なカメラビューを開き、カメラのフィールドを表示するには、 "ON"の位置にトグルスイッチをクリックし適切な名前トライアルをダブルクリックします。そして、記録を開始するために、録音ボタンをクリックします（カメラが記録している間に録画ボタンが赤のままになります）AND録音を停止するには、もう一度録音ボタンをクリックします。 この初期制御膨満試験の終了時に、緩め/組織セグメントは、内腔の外に膨らませる液体を推進できるように、尾方カテーテルを閉塞するクランプを取り外します。 10分間の再平衡期間の後、セグメント（ 例えば、短鎖脂肪酸またはデカンの推進運動性を変更するために管腔の流体中の栄養素、生物活性剤、薬剤、またはアゴニスト/アンタゴニストの種々のでこの手順を繰り返し酸）10,18。 バブルの進行結腸内腔への新たなソリューションの灌流時にユーザが時実験流体を知ることができるようになりますように、新しい実験的な流体は、結腸セグメントに入ったときにゲージを支援するために、注射器の港の近くに気泡を残します内腔に達しています。 バブルはを完全に押されたまで開い尾方カテーテルを用いて管腔内灌流を続行管腔潅流システム（灌流液2〜3mlのが必要な場合があります）。その後、組織セグメントが最大5分間開いた尾方カテーテルを通して流体を排出することができます。 注：この手順の後、内腔は内腔に液体の既知の体積の灌流を可能にすること、流体の無視できる量が含まれています。 シリンジを介して制御条件のように流体を膨らませるのと同じ量を注入する（ステップ4.3のように）、チューブクランプを使用して、尾方管腔カテーテルチューブを再閉塞。後で分析と（ステップ4.5のように）制御クレブス条件との比較のために実験期間中の運動パターンを記録します。 繰り返しセクション4.4 – 異なる管腔の化合物または同じ管腔化合物の濃度の異なるプロトコルの4.7。 5.時空間マップの構築（STmaps） 実験の記録が完了した後、分析風を開くために、特定の試験の名前をダブルクリックしますOW STMAPの建設のため。 ビデオ再生エリア内では、分析のための画像が適切にするために、分析ウィンドウでコントラストと明るさスライダを調整し（明るい背景に黒い組織シルエット; 図4）。 注：カメラキャリブレーションは、画像のみ、この時点ではより少ない程度に変更することができ、実験を開始する前に、適切に行われなかった場合。 画像が適切に対比されると、分析のための組織領域を分離し、成果物を含む領域を削除するには、ビデオ画像のウィンドウ内で水平方向と垂直方向の赤のガイドラインを設定します。また、開始を決定することによって、記録から適切な時間セグメントを選択し、分析のための時点を停止します。 具体的には、解析ソフトの中に緑色の「A」、黄色の「B」ボタンを使用して、ビデオ内の開始点と終了点を選択します。分析するためにビデオセグメントの先頭にタイムスライダを設定し、nは緑の ''ボタンをクリックします。その後、分析し、黄色の「B」ボタンをクリックするセグメントの最後にスライダーを設定します。 次に、STMAPウィンドウを開き、「ストップウォッチ」ボタンをクリックして「モータ分析]タブをクリックします。ストップウォッチをクリックした後、次のSTMAP生成を開始するために記録された映画の中の組織の黒いシルエットの中に十字線カーソルをクリックします。 組織シルエットで十字線をクリックすると、ソフトウェアが生成し、ビデオのその地域のSTMAPが表示されます。 注：これは、分析のために選択したビデオの長さに応じて数分かかることがあります。 画像を調整するSTMAPとコントロールの拡大画像を表示する「ズーム」をクリックします。 代わりにグレースケールの色としてSTMAPを表示するには、新しく作成されたウィンドウ内の「色」オプションをクリックします。また、マップやV内の特定のピクセルにカーソルを置くことができるように「有効にする」オプションをクリックしますその特定の組織領域のための管腔直径の変化の追跡IEW。完了したら、[終了]をクリックします。 論文やプレゼンテーションに使用するためにSTMAPをエクスポートまたはその後「メタファイルを ''データのエクスポート」を選択し、続いて「ファイル」メニューを選択することで、ImageJの中でさらに分析すること。その後の.emfファイルとして保存されますSTMAPを、名前を付け、「保存」ボタンをクリックします。 代わりに、スクリーンショットをキャプチャすることにより、STMAPの画像を保存します。これは、STMAPの擬似カラーバージョンを保存することが必要です。 STmapsで収縮波速度の6分析収縮の伝播や収縮持続時間の速度を分析するために、最初.TIFF、.GIF、.JPG、または任意のファイル変換プログラムを通じてImageJのに受け入れられるの.bmpフォーマットにSTMAPの.emfファイルに変換します。 注：ImageJのソフトウェアからSTmapsのの.emf形式の出力を開きません。 Alternativエリー、画面上のSTMAPの写真を取り、適切なファイル形式で保存するためにスクリーンショットのキャプチャソフトウェアを使用しています。 その後、ImageJの中に再フォーマットされたSTMAPを開き、「プラグイン」メニューと選択」GIMMProcessorを開いてGIMMProcessorプラグインを開きGIMMProcessor」と「測定値表」の窓」。これは、両方を開きます」。 ImageJのウィンドウ内で「長方形選択ツール」をクリックし、STMAPの右上隅にあるスケールバーの全領域をクリックしてドラッグすることで概要を説明するために使用します。その領域を選択した後、プラグインで「セットのキャリブレーション」ボタンをクリックします。最後に、スケールバー上の値に応じて、キャリブレーションボックスに適切な距離（mm）でと時間（秒）を挿入し、「完了」をクリックします。 次に、ImageJのウィンドウでライン描画ツールをクリックします。目の角に沿って伝播する収縮の中心を通ってSTMAPに線を引きますクリックしてSTMAP画像上にドラッグすることで、電子スロープ。代わりに、収縮持続時間を決定するために、非伝播収縮のバンドを通して垂直線を描画します。 行は（唯一の行が一度に描画される場合があります）適切に描画された後、水平距離、垂直距離、及び直線の傾きの読み出しを生成するプラグインで「測定を行う」ボタンをクリックします。それぞれ長さ（mm）、時間（秒）、速度（mm /秒）に対応します。このデータは、「測定値を表」ウィンドウに表示されています。 線画を繰り返し、分析は、与えられたSTMAP内で複数回のステップと.gmdファイルとしてデータを保存します。プラグインで「保存」ボタンをクリックし、ファイルに名前を付けます。次に、プロセスを完了するために、再度「保存」をクリックします。これらのデータは、後に他の試験データまたはSTMAPで使用するために再描画線と比較することができます。