От конструктов в кристаллах - в сторону структуры Определение β-ствольных белки наружной мембраны
Summary
β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.
Abstract
Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.
Introduction
β-бочка ОМР можно найти только во внешних мембранах митохондрий, хлоропластов и грамотрицательные бактерии 1-3. В то время как они служат аналогичные роли в качестве альфа-спиральных белков, они имеют очень разные складку, состоящий из центральной области β-бочка мембраны встраиваемый в диапазоне от 8-26 антипараллельными бета-нитей с каждой пр дь тесно связан с двумя соседними нитями (фиг.1 и 2). Первый и последний пряди области β-бочка затем взаимодействуют друг с другом, почти исключительно в анти-параллельно (за исключением митохондриальной VDAC), чтобы закрыть и загерметизировать домен β-бочка из окружающей мембраны. Все ОМР β-бочка имеют внеклеточные петли разной последовательности и длины, которые играют важную роль в лигандных взаимодействий и / или белок-белковых контактов, причем эти петли иногда быть как большой, как 75 остатков, например, найти в Neisseria, трансферрин связывания проTein A (TbpA) 4. β-бочка ОМР может также иметь N-концевые или С-концевые периплазмической расширения , которые служат в качестве дополнительных доменов для функционального назначения белка (например, Бама 5-7, FimD 8,9, ФАДЛЬ 10). Хотя многие типы β-ствольных ОМР существует 11, два из наиболее распространенных типов описаны ниже в качестве примеров для тех , кто менее знаком с полем, (1) TonB-зависимых транспортеров и (2) автовозы.
TonB-зависимых транспортеров (например, FEPA, TBPA, BtuB, Cir и т.д.) имеют важное значение для импорта питательных веществ и содержат N-концевой домен подключаемый модуль , состоящий из ~ 150 остатков , который находится внутри , заправленные С-концевой 22-многожильный β- Несколько доменов ствол встроен в наружную мембрану 12 (рисунок 3). В то время как этот плагин домен предотвращает субстрат свободно проходя через домен ствола, связывающий субстрат индуцирует конформационные изменения в домене штекером гопри приводит к образованию пор (либо с помощью штекера перегруппировки или путем частичного / полного выталкивания пробки), который затем может облегчить транспорт субстрата через внешнюю мембрану в периплазму. TonB-зависимых транспортеров особенно важны для выживания некоторых патогенных штаммов грамотрицательных бактерий , таких как менингококк, которые эволюционировали специализированные транспортеры , которые угнать питательные вещества , такие как железо непосредственно из белков человека принимающих 4,13,14.
Автовозы относятся к V системы секреции типа грамотрицательных бактерий и бета-баррель ОМР, которые состоят из области β-бочка (как правило, 12-нитей, как с ЭСТА и ESPP) и домен пассажира, который либо секретируются или представленные на поверхность клеток 15,16 (рисунок 3). Эти β-бочка ОМР часто служат важную роль в выживании клеток и вирулентности с доменом пассажирской обслуживающей либо как протеаза, адгезина, и / или других Е.Ф.Fector, что связующим звеном патогенеза.
Структурные методы, такие как рентгеновская кристаллография, ЯМР-спектроскопии и электронной микроскопии (ЭМ) позволяют определить модели для датчиков OMP с атомным разрешением, которое в свою очередь может использоваться, чтобы расшифровать точно, как они функционируют в пределах внешней оболочки. Эта бесценная информация может быть затем использована для лекарственных средств и вакцин развития, если это применимо. Например, трансферрин – связывающий белок А (TbpA) находится на поверхности Neisseria и необходим для патогенеза , поскольку она непосредственно связывается с человеческим трансферрином , а затем извлекает и импортирует железо для своего собственного выживания. Без TbpA, Neisseria не может продувать железа из человеческого организма и оказываются непатогенные. После того, как была решена кристаллическая структура человеческого трансферрина , связанного с TbpA 4, стало гораздо яснее , как связаны эти два белка, каких регионах TbpA опосредованное взаимодействие, какие остатки играют важную роль для извлечения железа путем TbpA, икак можно было бы разработать терапевтические средства против Neisseria таргетинга TbpA. Поэтому, учитывая важность β-ствольных ОМР в грамотрицательных бактерий для выживания и патогенеза, а также в митохондриях и хлоропластов функции, а также необходимость дополнительной структурной информации об этом уникальном классе мембранных белков и систем, в которых они функционируют общие протоколы представлены с общей целью выражения и очистки целевых ОМР на высоких уровнях для определения характеристик структурными методами.
Protocol
Representative Results
Discussion
β-бочка ОМР выполняют важные роли в грамотрицательные бактерии, митохондрии и хлоропласты и являются важными объектами для структурного анализа, которые предлагают огромное количество информации о существенных молекулярных механизмов на внешних мембран этих соответствующих органе…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Herve Celia of the CNRS for providing the UV images and Chris Dettmar and Garth Simpson in the Department of Chemistry at Purdue University for providing the SONICC images. We would like to acknowledge funding from the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases and the Intramural Research Program at the National Institutes of Health. Additionally, we would like to acknowledge additional funding from the National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. and C.J.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), and the Department of Biological Sciences at Purdue University (N.N.).
Materials
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | – | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | – | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | – | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | – | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | – | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | – | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | – | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | – | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | – | |
| SS34 rotor | Sorvall | – | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | – | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | – | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | – | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | – | |
| Gas-tight syringe (100 mL) | Hamilton | ???? |
References
- Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
- Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
- Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
- Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
- Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
- Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
- Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
- van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M., Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
- Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
- Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
- Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
- Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
- Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
- Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
- Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G., Engelman, E. H., Tamm, L. K. . Comprehensive Biophysics. 5, 139-163 (2011).
- Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
- Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
- Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
- Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
- Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., Coligan, J. E. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).
- Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383 (2012).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000 (2012).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
- Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
- Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
- Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
- Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
- Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
- Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
- Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377 (2006).
- Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?. BMC Genomics. 13, 510 (2012).
- Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
- Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
- Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
- Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
- White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
