SH-SY5Yヒト神経芽腫細胞株の分化
Summary
It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.
Abstract
Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.
Introduction
ビトロモデル系で使用する能力は、神経生物学と神経科学の分野を大幅に強化しました。培養中の細胞は、タンパク質の機能と特定の現象の根底にある分子メカニズムを特徴づけるために病気や感染症の病態を理解するために、予備薬物検査の評価を実施するための効率的なプラットフォームを提供します。神経生物学では、細胞培養モデルの主要なタイプは、ラットB35細胞5、ニューロ2Aマウスセル 6、およびラットPC12細胞を7としてラットおよびマウス、および神経芽細胞腫細胞株に由来する初代神経細胞培養物を含みます。このような細胞株の使用が大幅にフィールドを進めているが、非ヒト細胞および組織を処理に関連するいくつかの交絡因子が存在します。人間と比較した場合、これらは理解種特異的代謝過程の違い、病気の症状、および病原性の表現型が含まれます。ことに注意することも重要です再齧歯類モデルおよび経路は、げっ歯類およびヒト8-11との間で保存されているの理解の重要性の限界を強調し、マウスとヒトの遺伝子発現と転写因子のシグナル伝達の間に有意な差です。他のものはN-テラ-2（NT2）ヒト奇形癌細胞株および誘導多能性幹細胞（iPS細胞）を含むヒト神経細胞株の使用を採用しています。これらの細胞株は、 インビトロでのヒト・システムのための優れたモデルを提供します。しかしながら、レチノイン酸（RA）、ニューロン、星状細胞の混合集団の発生をもたらし、さらなる精製工程を必要と放射状グリア細胞12とNT2細胞の分化は、ニューロンの純粋な集団を得ました。また、NT2細胞は、細胞の72％より大きい60染色体で、非常に可変性核型13を示しています。性IPSCは、異なる細胞株の間の区別の変動を示し、分化効率が変化します 14。これらの選択肢を補完するために一貫して再現性のヒト神経細胞モデルを有することが望ましいです。
SH-SY5Y神経芽細胞のような細胞は、親の神経芽細胞腫細胞株SK-N-SHのサブクローンです。親細胞株は、神経芽細胞様および上皮様細胞15の両方含ま骨髄生検から、1970年に生成されました。 SH-SY5Y細胞は、47の染色体からなる、安定な核型を有し、かつ異なるRAの使用を含む機構、ホルボールエステル、およびそのような脳由来などの特定のニューロトロフィンの様々を通して成熟ヒトニューロンへの神経芽細胞のような状態から区別することができます神経栄養因子（BDNF）。前の証拠は異なる方法の使用は、アドレナリン作動性、コリン作動性、およびドーパミン作動性ニューロン16,17のような特定のニューロンのサブタイプに選択できることを示唆しています。この後者の側面は、神経生物学実験の多数のためのSH-SY5Y細胞が有用となります。
ontent ">いくつかの研究は、未分化および分化した状態で、SH-SY5Y細胞との間の重要な違いを指摘している。SH-SY5Y細胞が未分化である場合、それらは急速に増殖し、非常に少数の、短いプロセスと、非偏光であるように思われる。彼らは多くの場合、成長します塊および分化、これらの細胞は増殖の減少、長く、分枝プロセスを拡張し、場合によっては2,18を偏光する。未成熟ニューロン18,19を示すマーカーを発現する。完全に分化したSH-SY5Y細胞は、以前に発現することが実証されています成長関連タンパク質（GAP-43）、ニューロン核（NeuNの）、シナプトフィジン（SYN）、シナプス小胞タンパク質II（SV2）、ニューロン特異的エノラーゼ（NSE）と微小管関連タンパク質（MAP）を含む成熟ニューロンの異なる様々なマーカー2,16,17,20、および4。SH-SY5Y細胞の分化をさらに支持するものreprese例えばグリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）のようなグリアのマーカーの発現を欠いているためにntの均質なニューロン集団は、BDNFの除去は、細胞のアポトーシスを4になります。これは、分化したSH-SY5Y細胞の生存は、成熟ニューロンに類似栄養因子に依存することを示唆しています。サブクローンは、1978年3に設立されて以来、SH-SY5Y細胞の使用が増加している。その使用のいくつかの例としては、パーキンソン病17、アルツハイマー病21、およびポリオウイルス22などのウイルス感染症の病因、エンテロウイルス71（EV71）23,24を調査含ま、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）1、ヒトサイトメガロウイルス25、および単純ヘルペスウイルス（HSV）2,26。 SH-SY5Y細胞を用いたいくつかの研究は、特に神経ウイルス学27-36の分野において、その未分化形態において、これらの細胞を使用していることに留意することが重要です。分化したSH-SY5Y細胞対未分化の観察された表現型の違いは、WHEの問題を提起しますTHER感染の観察進行が成熟分化したニューロンで異なるだろう。例えば、分化したSH-SY5Y細胞は、原因HSVに結合し、未分化SH-SY5Y細胞2のエントリを調節する表面受容体の欠如にすることができる未分化、増殖するSH-SY5Y細胞に対するHSV-1の取り込みのより高い効率を有します。 in vitroでのニューロンのテストに焦点を当てた実験を設計する際に、SH-SY5Y細胞をin vivoモデルに変換し、比較のために最も正確な結果を得るためには区別されるべきであることが重要です。
ヒトニューロン培養物を生成するための信頼できる方法の開発は、研究者は正確に人間の神経系をモデル化する翻訳実験を実行することを可能にするのに不可欠です。ここで紹介するプロトコルは区別されている人間の神経細胞を濃縮するために、従来の方法1-4由来のベストプラクティスを描く手順ですレチノイン酸を使用。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記のプロトコルは、均質かつ実行可能な人間の神経細胞培養を生成するための簡単で再現性のある方法を提供します。このプロトコルは、いくつかの以前に公開された方法1-4を統合手法と実践を利用し、それぞれのベストプラクティスを描写することを目指しています。 SH-SY5Y細胞の分化は、緩やかな血清欠乏に依存しています。レチノイン酸、神経栄養因子および細胞外マト…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful for the contributions of Yolanda Tafuri in optimizing conditions for SH-SY5Y differentiation, and for the support of Dr. Lynn Enquist, in whose lab this work was initiated. Y. Tafuri contributed the images shown in Figure 3. This work was supported by the NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR) Bioinformatics Resource Center (MLS and L. Enquist) and K22 AI095384 (MLS).
Materials
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | – |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | – |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | – |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | – |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | – |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | – |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | – |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | – |
| Falcon 35mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | – |
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