La differenziazione del SH-SY5Y neuroblastoma umano linea cellulare

La possibilità di utilizzare in sistemi modello in vitro ha notevolmente migliorato i campi della neurobiologia e neuroscienze. Le cellule in coltura forniscono una piattaforma efficiente per caratterizzare la funzionalità delle proteine ​​e dei meccanismi molecolari alla base dei fenomeni specifici, per comprendere la patologia di malattie e infezioni, e di effettuare valutazioni preliminari di prova della droga. In neurobiologia, i principali tipi di modelli di coltura cellulare includono colture neuronali primarie derivate da ratti e topi, e le linee di cellule di neuroblastoma come le cellule di ratto B35 ^5, Neuro-2A cellule di topo ^6, e le cellule di ratto PC12 ^7. Sebbene l'uso di tali linee cellulari ha avanzato significativamente il campo, ci sono diversi fattori confondenti associati alla manipolazione cellule non e tessuti umani. Questi includono la comprensione specie-specifiche differenze nei processi metabolici, fenotipi di manifestazione della malattia, e la patogenesi rispetto agli esseri umani. E 'anche importante notare che ilre sono differenze significative tra il mouse e l'espressione genica umana e segnalazione fattore di trascrizione, mettendo in evidenza i limiti dei modelli di roditori e l'importanza di comprendere quali percorsi sono conservati tra i roditori e gli esseri umani ^8-11. Altri hanno impiegato l'uso di linee cellulari neuronali umani, tra cui la N-Tera-2 (NT2) linea di cellule umane teratocarcinoma e le cellule staminali pluripotenti inducibile (iPSCs). Queste linee cellulari forniscono buoni modelli per i sistemi umani de vitro. Tuttavia, la differenziazione delle cellule NT2 con acido retinoico (RA) comporta la generazione di una popolazione mista di neuroni, astrociti e cellule gliali radiali ^12, che richiedono un ulteriore stadio di purificazione per ottenere popolazioni pure di neuroni. Inoltre, cellule NT2 mostrano un cariotipo altamente variabile ^13, con più del 60 cromosomi in 72% di cellule. iPSCs dimostrano variabilità nella differenziazione tra diverse linee cellulari e variano in termini di efficienza differenziazione ^14. E 'quindi auspicabile disporre di un modello di cellule neuronali umane e riproducibile per completare queste alternative.

cellule neuroblasti-like SH-SY5Y sono un sottoclone della parentali cellule di neuroblastoma SK-N-SH. La linea cellulare parentale è stato generato nel 1970 da una biopsia del midollo osseo che contiene sia neuroblast-like e cellule ^{epiteliali-come} 15. cellule SH-SY5Y hanno un cariotipo stabile composto di 47 cromosomi, e possono essere differenziati da uno stato neuroblast simile in neuroni umani maturi attraverso una varietà di meccanismi diversi, tra cui l'uso di RA, esteri del forbolo, e neurotrofine specifici come derivato dal cervello fattore neurotrofico (BDNF). Prove Prima suggerisce che l'uso di metodi differenti può selezionare per specifici sottotipi neuronali come adrenergici, colinergici, e neuroni dopaminergici ^16,17. Quest'ultimo aspetto rende le cellule SH-SY5Y utili per una moltitudine di esperimenti neurobiologia.

ontent "> Diversi studi hanno notato importanti differenze tra le cellule SH-SY5Y nei loro stati indifferenziati e differenziati. Quando le cellule SH-SY5Y sono indifferenziate, che rapidamente proliferano e sembrano essere non polarizzata, con pochissime, processi brevi. Spesso crescono in gruppi ed esprimere marcatori indicativi di neuroni immaturi ^18,19. Quando differenziate, queste cellule si estendono lungo, ramificata processi, diminuzione della proliferazione, e in alcuni casi polarizzano ^2,18. cellule SH-SY5Y completamente differenziati sono stati precedentemente dimostrato di esprimere un varietà di diversi marcatori di neuroni maturi tra cui proteine ​​di crescita-associata (GAP-43), i nuclei neuronali (NeuN), synaptophysin (SYN), delle vescicole sinaptiche proteina II (SV2), enolasi neurone specifica (NSE) e proteine ​​associate ai microtubuli (MAP) ^2,16,17,20, e mancare espressione di marcatori gliali come la proteina silicea fibrillare gliale (GFAP) ^4. a ulteriore sostegno che differenziano le cellule SH-SY5Y RAPPRESEnt una popolazione neuronale omogenea, la rimozione di BDNF si traduce in apoptosi cellulare ^4. Questo suggerisce che la sopravvivenza delle cellule SH-SY5Y differenziate dipende da fattori trofici, simile a maturare neuroni.

L'utilizzo di cellule SH-SY5Y è aumentato rispetto alla subclone è stata fondata nel 1978 ^3. Alcuni esempi del loro uso includono indagare la malattia di Parkinson ^17, il morbo di Alzheimer ^21, e la patogenesi delle infezioni virali tra cui poliovirus ^22, enterovirus 71 (EV71) ^23,24 , virus varicella-zoster (VZV) ^1, citomegalovirus umano ^25, e il virus herpes simplex (HSV) ^2,26. È importante notare che diversi studi utilizzando cellule SH-SY5Y hanno utilizzato queste cellule nella loro forma indifferenziata, soprattutto nel campo della neurovirology ^27-36. La differenza nel fenotipo osservato di indifferenziata rispetto a cellule SH-SY5Y differenziate pone la questione di whether la progressione osservata dell'infezione sarebbe diversa nei neuroni differenziati maturi. Ad esempio, le cellule SH-SY5Y differenziati hanno una maggiore efficienza di HSV-1 captazione contro, proliferano le cellule SH-SY5Y indifferenziate, che può essere a causa della mancanza di recettori di superficie che legano HSV e modulano l'ingresso sul indifferenziate cellule SH-SY5Y ^2. È quindi importante che quando si progetta un esperimento focalizzata sui test neuroni de vitro, cellule SH-SY5Y dovrebbero essere differenziati al fine di ottenere i risultati più accurati per la traduzione e confronto di modelli in vivo.

Lo sviluppo di un metodo affidabile per generare colture neuronali umane è indispensabile per consentire ai ricercatori di effettuare esperimenti traslazionale che modellano con precisione il sistema nervoso umano. Il protocollo qui presentata è una procedura che delinea le best practice derivate da metodi precedenti ^1-4 per arricchire per i neuroni umani che si differenzianocon acido retinoico.