JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

Мышь Круглый окно подход к ототоксичных агента доставки: быстрое и надежная техника для индукции Cochlear Cell дегенерации

Published: November 26, 2015
doi:
10.3791/53131
, , ,
1Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,Medical University of South Carolina, 2Department of Pathology and Laboratory Sciences,Medical University of South Carolina, 3Intuitive Surgical, Inc

Summary

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

Abstract

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Introduction

Следователи использовали широкий спектр моделей на животных для изучения нормальной функции слуховой системы, а также патофизиологии потери слуха. Эти модели также весьма полезным для проведения интервенционных исследований в отношении различных патологических процессов и служат основой для трансляционных приложений в людях. Для большинства исследований с участием улитки и связанные слуховые пути, некоторая степень повреждения или разрушения должны быть введены в систему. Часто, повреждение намеренно направлен на создание специфического повреждения, что позволяет исследователям изучить влияние этого поражения на нормальной функции, а также улитки способности, чтобы оправиться от него. При выборе конкретной модели животных и / или технику (ы) для введения ущерб, ряд факторов должны быть рассмотрены для достижения наилучших результатов. Различные модели на животных могут по-разному реагировать на вмешательство, в то время как прямые, так и косвенные последствия методики могут бытьполностью вредным для желаемого результата. В большинстве случаев, протокол идеально подходит внутренний ущерб уха позволит избежать системной токсичности, быстро и надежно производить ущерб, создать точную и последовательную поражение, и быть живучей, чтобы дальнейшее изучение функциональных, клеточных и молекулярных изменений. В идеале, эти методы также сохраняют бы нежные микроархитектуру и электрохимические градиенты улитки, чтобы в максимально возможной степени.

На сегодняшний день исследователи удалось создать ряд методов, чтобы побудить внутренний травму уха. Большинство из них влечет за собой разоблачение улитку на ототоксичных агента либо системно, либо с помощью хирургического подхода. Методы включают парентеральной инъекции, интраперитонеально, транс-барабанная инъекции, инъекции эндолимфатического мешка, и cochleostomy с perilymphatic перфузии. Эти методы были использованы для введения различных ототоксических агентами, такими как фуросемид, гентамицин, оуабаином и гептанола. 1-5В то время как успех в создании конкретных кохлеарные повреждения, указанные выше методы также признали ограничения. Системные инъекции могут быть весьма токсичны для животного, и может быть связано с непредвиденным кохлеарных оскорблений и противоречивых результатов. Последнее недостаток также были связаны с транс-барабанной инъекций. Такие методы, как cochleostomy и perilymphatic перфузии, в то время как способно индуцировать быстрые и надежные поражений высокой, непосредственно инвазивного к внутренней структуре уха и функции. Многие из хирургических подходов, также связаны с высокой степенью технической сложности и может потребовать оставляя посторонние предметы в животных, таких как микронасос заварки. 2-4,6-8 Ни один метод не свободен от недостатков, и следователи должны выбрать методы тщательно, чтобы соответствовать их потребностям экспериментальные. Здесь мы опишем, в деталях, круглое окно ниша (RWN) технику приложений для местной доставки ототоксичных агентов у взрослых мышей.

Fiпервый описано Husmann соавт в 1998 при изучении эффекта гентамицина на сенсорной дегенерации волосковых клеток в птичьего модели, этот метод был найден, чтобы быть способным производить значительно более надежные поражений, чем системной гентамицина применения, в то время избегая связанных с токсичностью. 9 С тех пор ряд других исследователей, в том числе нашей лаборатории, использовали эту технику для большого успеха. В 2004 году, Хейдт др. адаптировать его к модели мыши и описано улучшенную способность контролировать размер повреждения при заполнении RWn с губкой впитывающийся желатина, пропитанной различными концентрациями гентамицина. 10 Палмгрен и др., в 2010 году, изучал ототоксичен эффекты бета-бунгаротоксина, мощным элемент в яде тайваньцев объединились ящик, применяя водный вид этого списка Rating Watch с взрослых крыс. 11 Кроме того, количество предыдущих исследований, проведенных в нашей лаборатории использовали круглую подход окно для изучения ототоксичных эффекты фуросемидае, уабаин и гептанол. 5,6,12-15 Результаты этих исследований показали важность кохлеарной жидкости и ионов гомеостаза на нормальный слух, обнаружил способность пролиферации клеток в спирального ганглия и улиткового боковой стенке, и способствовало наше понимание возрастная потеря слуха.

Следующий подход предполагает хирургическим доступа среднего уха через разрез заушной и частичной удаление свода костной барабанной буллы. Это обеспечивает превосходные экспозиции RWN и мембраны, к которому выбранный ототоксичен агент может быть непосредственно применен. Жидкость агент затем бассейны в чашеобразной котловине списка Rating Watch (или медленно стекает из насыщенного рассасывающиеся желатин губки носителя упакованы в списка Rating Watch) и диффундирует через мембрану круглого окна в perilymphatic пространстве улитки вестибюле. Нет прямого cochleostomy не сделал в этом подходе. Преимущества этого метода включают в себя сохранение внутреннего уха микроархитектуре, избежаниисистемной токсичности, рационе с контрольной уха внутри животного, быстрое начало действия, селективный дегенерации в некоторых типах кохлеарный клеток (например., тип I спирального ганглия нейронов с оуабаин воздействия и кохлеарного типа II фиброцитов индуцированные лечения гептанола), и воспроизводимые результаты / надежные. Этот метод может быть применен с некоторыми изменениями между другими видами грызунов, в том числе крыс, морских свинок, песчанок и. Недостатки включают в себя крутой кривой обучения технического и относительную ограниченность ототоксичных оскорбление, ограничиваемый в одной точке во времени.

Protocol

Все аспекты исследований на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами соответствующего комитета Институциональная животных уходу и использованию. Все экспериментальные процедуры позвоночных животных, описанные здесь, были одобрены в соответствии с руководящими Медицинского университета комитета (MUSC) Институциональные животных уходу и использованию Южной Каролины (IACUC). Выбор 1. Модель Поддерживать животную модель в малошумного вивария с обычной соц за институциональных протоколов до готовности к использованию. В животноводстве исследований (ARF, сооружения), поддержание стабильности вибрация, шум демпфирования, суточный освещение, подготовительные пространство, отделки поверхности, уплотнения и уплотнительных и вентиляции, которые отвечают стандартам NIH. Примечание: Национальные Институты Здоровья (NIH) руководящие принципы для ARF, и поддержания низкого шума виварии может быть рассмотрен на: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ Для всех экспериментов, используйте правое ухо в качестве экспериментальной ухо. Левое ухо служит контролем внутри животного и не хирургическим путем изменили. Осмотрите модель животное до операции признаки среднего или наружного уха инфекции. Потенциальные признаки могут включать дренаж жидкости или гноя из уха, воспаление ушной раковины ткани, и / или вялость животного. Это необычно, но если отметил, избежать дальнейшего хирургии и лечения животное надлежащим образом. 2. Предоперационная процедуры Обезболить животных 30 мин до операции и любых послеоперационных процедур через интраперитонеального (IP) инъекции кетамина (100 мг / кг IP) и ксилазина (20 мг / кг IP). Дополнение анестезии, при необходимости, о чем судили по положительному ног-пинча рефлекс, с более низкой дозировке кетамина (25 мг / кг, внутрибрюшинно) и ксилазина (5 мг / кг IP). Определить дозирования в соответствии с институционально разрешено протоколов мышей с возрастным соответствующих корректировок в дозе. Проверьте для полной сedation модели. Проверьте сценического 3 плоскости анестезии для полноты описанного протокола отмечен очередной частоты дыхания, отсутствие рефлекса (у мышей), а отсутствие педали и глазных (схождение прижимные) рефлексов. Поддержание животное на этом уровне анестезии. Это имеет первостепенное значение для минимизации боли и интраоперационной движения, кровотечения, и утечки внедренных жидкостей во время операции. Поддерживать температуру тела животного на 37,5 ° C с замкнутым контуром грелку. Администрирование обезболивание с помощью подкожных инъекций бупренорфина. Доставка бупренорфин (0,1 мг / кг SQ раз 30 мин до операции), как обезболивание, чтобы минимизировать любой хирургической дискомфорта. База дозирования и альтернативные варианты, с выбранной моделью на институционально одобренных протоколов. Антибиотики использование не является необходимым, если хорошо асептический метод практикуется. Животные получают послеоперационную анальгезию, если есть признаки боли и страданий. Выполните телysiologic испытания до операции. Выполнение слуховой ответ ствола мозга (ABR) тестирование и / или искажениям оптико-акустический тестирование выбросов (DPOAE) и предварительно оперативно и непосредственно перед пожертвовать животного служит объективного измерения для эффекта выбранного ототоксичных агента услышав мыши. 3. Хирургическая подготовка и позиционирование Стерилизовать все инструменты перед операцией за институциональных стандартов. Подготовка хирургических инструментов и поле в согласованном, стерильной и организованно, чтобы избежать ненужных усилий и движения во время процедуры. Требуется Типичные инструменты входят острые ножницы рассечения, несколько пар металлических щипцов с советами ювелирных А.Н. отологический пикап, А.Н. отологический кюретку, и биполярная электрокоагуляция единичных (Рисунок 1). Подготовка и стерилизации бумажные фитили, изготовленные из labwipes заранее путем разрезания небольшой треугольный кусок уничтожить (~ 0,7 в в х 1,25 в х 1.75 в) и скручивания его плотно между большим и указательным пальцами одной руки (~ 1.25 в). Создание плотно скрученной, чрезвычайно тонкой фитиля имеет первостепенное значение для успеха процедуры. Подготовка общей сложности 15-20 фитилей до операции (рисунок 2). Используйте бормашины быстро проколите кость барабанной буллы в контролируемым образом. Использование ременной стоматологическая ручной дрелью с 1 или 2 мм трапециевидного кончика предпочтительнее. Оперативник микроскоп, необходимо заполнить протокол. (см Шаг 4.7) Предварительно обратить 0,2 мл водного раствора, содержащего выбранный ототоксичен агента в 1 мл туберкулина шприца с 28 G, 1/2 'иглы. Обычно 1 капля (~ 10 мкл) агента достаточно, чтобы полностью заполнить RWn мыши. Металлический, тупым кончиком иглы шприца облегчает доставку агента, предотвращая повреждение структуры, лежащие в основе резкой конической оконечности. Выгнать воздух в любой шприц, как пузырьки могут непреднамеренно заполнить RWn и / или предотвращения собственноПрименение агента самого круглого окна. Удалить мех от пост-ушной кожу с помощью электрических холить ножницы. Удалить мех в зоне, простирающейся от аурикуло-головной складки рострально к плечевого пояса каудально. Продлить удаление волос от спинного, сагиттальной средней линии угла нижней челюсти с боков. Правильное удаление мех имеет первостепенное значение для поддержания чистой и прозрачной операционного поля. Аккуратно почистить вырезки из предполагаемого хирургического вмешательства. Стерилизовать кожу подготовленную поверхность в институциональных протоколов. Применение бетадин (повидон / йода) чередуются с этанолом местно по кругу в течение 2 мин. Другие агенты могут быть заменены на институциональных принципов. Поместите животное на плоской поверхности, чтобы поддерживать постоянную позиционирование тела во время процедуры. Используйте маленькую грелку размещены под корпусом на платформу, чтобы контролировать температуру тела во время процедуры для поддержания температуры тела животного на 36-38 ° С. Не Овеrheat животное, так как это может привести к легкой до тяжелой повреждения кожи и / или в начале эвтаназии. Закрепите голову животного с помощью держателя аппарата укус блок / головы. Используйте 0,5 см на 2 см накусочной вырезаются из латуни с 2-4 отверстиями диаметром мм, просверленные в ней 5 мм интервалами вдоль длинной оси. Откройте рот животного вокруг этого прибора и установите верхние центральные резцы в одно из отверстий в зависимости от размера животного. Аккуратно затяните небольшой зажим над тыльной морды животного, чтобы удерживать его на месте (рис 3). Убедитесь, что укус держатель блока / головки жестко связаны с центром в U-образной шарнирной рукой (рис 3). Безопасный 1см широкий стержень в левую руку от "U" и использовать стержень как подголовника левого бокового (правая сторона всегда оперативная сторона). После того, как прочно закреплен в держателе головки, повернуть мышь к левому боку пролежни. Расположите сторожны телаLLY на плоской рабочей поверхности, чтобы убедиться, что он будет стабильным на протяжении всей процедуры и избежать чрезмерного стресса на кручение на шейных позвонках. Расположите операционный микроскоп, способный 4x, 10x, 20x и увеличение в связи с хирургической области. Убедитесь, что микроскоп может сохранить свои позиции в громкой образом, это идеально подходит для двуручного хирургического протокола обсуждается ниже. Поставьте биполярного поддержкой прижигания блок с ручным кусок точная наклоненная ювелирного в положении, которое немедленно доступны для помощи в прижигания мелких сосудов и рассечения тканей. Это также может быть необходимо, должны тяжелее кровотечение встречаются. 4. Хирургическое подход При микроскопическом увеличении, используйте острые ножницы или лезвие скальпеля, чтобы создать 1-1,5 см заушной разрез, примерно 6-8 мм каудально к auriculocephalic складки. В взрослой мыши, разрез от средней линии спиныв боковом направлении в точке вблизи угла нижней челюсти является адекватным. Тщательно избежать сокращения глубоко, чтобы сохранить основные сосудистые структуры. Провести тщательный тупым путем подкожной жировой слой, который может быть переменной толщины. Жир может быть безопасно удалены, если это необходимо улучшение экспозиции. Будьте осторожны, когда рассекает в брюшной медиальной направлении, внешний яремной вены пересекает эту область и повреждение этой структуры может вызвать большие объемы кровопотери и затопления операционного поля. Контроль любого чрезмерного кровотечения с рассасывающиеся желатиновые губки и / или хлопковые шарики. Используйте биполярным прижиганием для более тяжелого кровотечения. После того, как слой жира правильно разделить, подвергать шейки мускулатуру. Примечание важные структуры в том числе большой мышечной теле cleidomastoideus централизованно в открытой хирургической области, наружной яремной вены вентрально, и околоушной ткани, покрывающей рострально угол нижней челюсти. Важной вехой является небольшой нерв Brancч (из черепных нервов XI), который оборачивается вокруг задней / спинной край cleidomastoideus расширить рострально к ушной раковины (рис 4). Осторожно втянуть тело cleidomastoideus мышц в направлении задней / спинной (фиг.4, 5). Аккуратно разделить прозрачный фасции, обволакивающая тело мышцы. Аналогичным образом, мягко убрать околоушной и внешний яремную вену в противоположном (передняя / вентральной) направлении (рис 5). С хорошим втягивания тела cleidomastoideus мышц, блестящие купола барабанной Булла надкостницы придет в поле зрения (рис 6). В каудальной буллы, вставка из глубокого шейного мышцы, sternomastoideus, придет в поле зрения (рис 6). Заповедник лицевого нерва, который становится видимым на спинной и ростральной аспекте Булла купола. Поставьте самоудерживающийся втягивающим (стерильная титана shaft– встроен в одноразовой силиконавставить) до бурения. С двуручным техники, мягко разделить Булла надкостницы с биполярным диатермии выставить основной кости. Использование щипцов или отологический кюретку, мягко поднять и нажмите надкостницы в периферийном направлении широко раскрыть Булла купол. Примечание: Шаг 4.6 имеет решающее значение для максимального хирургического вид среднего уха пространства. Использование дотошный и бережное обращение мягких тканей, чтобы избежать кровотечения и / или утечки межклеточной жидкости в полости Булла после бурения. По правильно подвергаются Булла купола, бурение 2 мм пилотного отверстия через Булла кости с зубной хирургического сверла между хвостовой края купола и заметно непрозрачной линии (представляющий барабанной перепонки), проходящий через ростральной аспекте буллы (рис 7). Позаботьтесь, чтобы развернуть только через кости, чтобы сохранить основные структуры, такие как стремянный артерии. Дрель отверстие второй пилот рядом, чтобы облегчить ООН-Кровля Булла кости (<сильный> Рисунок 7). Используя пару щипцов наконечник ювелирных, Открывать буллы кости в спинной и хвостовой направлении (рис 8). Удалить кости по частям под высоким увеличением. Не прокалывать стремянный артерии, которая находится непосредственно под крышкой Булла, а кровотечение из этой артерии может нарушить процедуру. Минимизировать количество кости удалены, чтобы предотвратить чрезмерное запись жидкости в среднем ухе, все еще ​​позволяя превосходную визуализацию и доступ к оконной нише круглого (рис 8). 5. Круглый окно приложения ототоксических агента Сделайте вращательные тонкие коррективы в держателе головки, чтобы принести RWn прямо в поле зрения. RWN обычно находится в спинной и хвостовой аспекте среднего уха пространстве и выглядит как чашеобразной отступа слухового капсулы кости. В большинстве случаев, стремянный артерии проходит 1-2 мм брюшной / Ростральные на это. RWN иногда может быть БКТрунец периферии под острым углами буллы купола. В таких случаях, точное размещение головы животного имеет первостепенное значение. Использование бумаги, подготовленные фитили до операции, удалить все видимые жидкости в среднем ухе и списка Rating Watch, пока сухой кости не визуализируется. Примечание: Это наиболее важный шаг всего протокола, как ~ 10 мкл (1 капля) ототоксических агента применяется к RWN можно легко разбавить этой жидкости. Под максимальным увеличением, используйте тонкую иглу калибра на 1 мл туберкулиновые шприцы применять одну каплю (~ 10 мкл) ототоксических агента непосредственно в списка Rating Watch, заполняя его полностью. Позаботьтесь, чтобы не нарушить стремянный артерии и внимательно наблюдать за замену небольшого отражения света на базе сухого нише с тупой и туманных жидкости мениска, как показатель того, что ниша правильно заполнения. Разрешить агент отдохнуть в списка Rating Watch на время экспозиции около 10 мин. После этого полностью WИк из агента и заменить его новым приложением того же агента. Определить повторений применения в соответствии с требованиями агента. Общее время воздействия в этой процедуре, как правило, колеблется от 30 до 60 мин. В конце процедуры, полностью фитиль от агента в последний раз и применить свежий агента в RWN. Оставьте буллу колпачков и использовать пинцет, чтобы закрыть мягкие ткани над хирургического сайта. Печать хирургического сайт на уровне кожи с 4-0, нерассасывающегося мононити шов. Поместите животное в клетке восстановления / станции. Монитор клиническое состояние животного регулярно после операции. Поддержание животное в надлежащих условиях окружающей среды, в том числе жилья с мягкой подстилкой и добавок с мягкой пищи, чтобы свести к минимуму стресс. Определить будущие процедуры и послеоперационные условия в соответствии с институциональными протоколов IACUC. Используйте институциональных протоколов IACUC стерилизовать инструментс перед использованием на следующей животного. Разрешить для правильного времени охлаждения между использованием прибора. 6. Послеоперационные процедуры и Cochlear ткани урожая Как описано в шаге 2.5, выполняют физиологическую тестирование слуха после операции на нужных точках и перед умерщвлением. Выполните послеоперационных процедур в соответствии с экспериментальными целями. Жертвоприношение животного на любом желаемом послеоперационный день. После полного наркоза через инъекции IP, как это требуется в институциональных протоколов IACUC, пожертвовать животное. Использование острыми ножницами, обезглавить животное просто хвостовой к затылку. Резко откройте свода черепа с ножницами вдоль спинной и брюшной средней линии и широкое распространение. Аккуратно выкопайте мозговой ткани, чтобы разоблачить височных костей. Примечание: количество процедур для расследования почтовых изменений экспозиции в улитке можно перейти с этой точки и будет упомянуто в разделе обсуждение. Определите способ расследования наиболее relevanт экспериментальным целей. Если электронная микроскопия планируется после улитка подразделяются, использовать катетеризацию сердца, чтобы предварительно зафиксировать ткань. Это выходит за рамки этой дискуссии и была покрыта в глубины другом месте. 13 Вырезать височных костей из основания черепа с ножницами и сразу же помещают в фиксатор решения. Погружают кости непосредственно в 4% параформальдегид в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Монитор время фиксации, а увеличенная продолжительность может ограничить результаты гистологического анализа на последующих этапах. Удаление накипи рассекали кости для переменной периода времени через погружение в 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).

Representative Results

В недавнем исследовании Стивенс и др использованием выше протокол, взрослые ЦБ / CAJ мышей обоих полов подвергались помощью круглого окна диффузии гептанол. 15 гептанол является щелевых ООН-переходник, как известно, производят целевые, извлекаемые травмы клеток кохлеарной боковая стенка. Цель исследования состояла в том, чтобы произвести надежную модель для целевой кохлеарной повреждения, что позволяет для исследования послеоперационного восстановления любых поврежденных элементов. Предоперационная и послеоперационные пороги слуха служили в качестве функциональной конечной точки. Микроскопия и иммуногистохимических методы окраски были использованы для изучения морфологических изменений. Значительное увеличение ABR порогов наблюдались в гептанол мышей, обработанных (рисунок 9). Контрольные животные, получавшие фиктивный операцию, с доставкой физиологического раствора вместо гептанола, не демонстрируют значительные сдвиги пороговые в любое тестирование частоты. Иммуноокрашивание против внутренне исправлениякалиевых каналов (Кир) 4.1 служил косвенным методом для визуализации повреждения / восстановления кохлеарных структур. Это свидетельствует высокую воспроизводимость различия между лечения и контроля уши. В целом интенсивность окрашивания заметно снизилась за полоски vascularis (STV), и среди фиброцитов спиральной связки (SLF) 1-3 дней после воздействия гептанола, обозначая большие объемы целевого повреждения этих областях. Был конкретный снижение интенсивности Кир 4.1 окрашивания в области II типа и типа IV SLFs (рисунок 10) и СТВ (Рисунок 11). Свидетельство нарушенного ядерной целостности и конденсации хромосом / пузырьков типичных сотовой апоптоза был также замечен на ядерных counterstains в этих областях улитки (рисунок 10). Вакуолизированы зоны Kir 4.1 окрашивание решены заметно на 7 дней и отсутствовали полностью на 14 дней. Когда Кир 4.1 окрашивание интенсивность количественно в таких областях, STV, обработанные уши продемонстрировали INITIаль корыта с последующим значительным сдвигом (р <0,05) назад к интенсивности управления через 7 дней после гептанола воздействия (рисунок 12). Рисунок 1. Инструмент создан. Описание предварительного хирургического наладки приборов. Все оборудование должно быть легко доступны в стерильной хирургической области. Типичный приборы включает в себя 2 острые ножницы рассечение, 2-3 прямо и / или зажим изогнутый Совет ювелирного с уха кюрет, изогнутые вала отологический выборы (позже замещен Розен берет – не показано), и электро-прижигание устройство с пинцетом изобразительное загнутой верхушкой ювелирного головной убор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. <img aл = "Рисунок 2" src = "/ файлы / ftp_upload / 53131 / 53131fig2.jpg" /> Рисунок 2. Хирургические расходные материалы. Дополнительные принадлежности для поддержания окружающей среды. RWn Стерилизованные labwipe вырезы для формирования бумаги фитиль (слева), плотно сформированный бумажный фитили сделаны из стерилизованных лабораторных салфеток (в центре), и 4 мм хлопка гранул (справа) используются, чтобы стереть лишнюю жидкость и наводнения крови в круглое окно нише. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3. Держатель Голова животного. Изображающая держатель головки и блока укуса изображения. Отверстия в блоке подходят и закрепите верхние центральные резцы. Зажим осторожно затянуть на спинной морды, чтобы обеспечить животное на месте. Использование держателя головки имеет решающее значение для успешного хирургического OUTCОме. В идеале, это должно быть в состоянии вращаться вокруг ростральной-хвостовой оси животного оптимизации хирургических вид на булла во время процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4. Cleidomastoideus. М. Схема график, изображающий основную анатомию шейного мускулатуры грызунов и его связь с наружной яремной вены. Cleidomastoideus мышц является наиболее легко идентифицировать мышцы во время хирургической подхода. Выпуск обволакивающей фасции с последующей задней / спинной втягивания тела мышц будет направлять хирургического вскрытия к барабанной буллы (черный круг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы смотреть АльARGER версия этой фигуры. Рисунок 5. Хирургическая область экспозиции. Изображает экспозицию после вскрытия через кожные и подкожные слои жира. Структурные достопримечательности включают в себя ноты филиал черепных нервов XI покрывающей мышцы cleidomastoideus (A), внешний яремную вену (б) и подвергается околоушной ткани (C). Черепного нерва XI филиал часто ассоциируется с небольшой сосуд и должно быть разделено до судебного разбирательства. Справа налево на изображение соответствует ростральной-хвостовой оси животного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 6. Демонстрация Булла. Воздействие на барабанной буллы после втягивания cleidomastoideus и окружающих структур. Известные достопримечательности включают тело cleidomastoideus мышцы (А) отражается сзади / дорсально, лицевого нерва (Б), и блестящие купола барабанной Булла надкостницы (C). Кроме того, обратите внимание на вставку sternomastoideus мышцы на левой каудальной барабанной буллы (звездочка). Наличие лицевого нерва в спинной и ростральной аспекте буллы является критическим ориентиром для идентификации истинной буллы. Справа налево на изображение соответствует ростральной-хвостовой оси животного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 7. Разоблачение круглое окно нишу я. Изображение, изображающие tympaNIC булла полностью открыты после рассечения вышележащих надкостницы. Пилот отверстие лучше всего поместить на полпути между каудальной кромке Булла куполом и тонким непрозрачным линии визуализируется в ростральной аспекте Булла (представляющий барабанной перепонки). Во-вторых, рядом пилот отверстие может облегчить легкий ООН-Кровля Булла кости. Избежание глубокого бурения должны быть приняты, чтобы не травмировать основной стремянный артерии. Темная, металлический предмет, в нижней части изображения титана мягких тканей втягивающее. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 8. Разоблачение круглое окно нишу II. Uncapped барабанная булла с воздействием круглого окна ниши (стрелка) и стремянный артерии (красный структура1-2 мм латеральнее нише), как смотреть под 20-кратным увеличением. Ниша часто лежит в положении поджав под острым углом, образованной Булла куполом с ушной капсулы в каудальной части купола. Это важно, что полная визуализация нише быть достигнуто до применения ототоксичных агента или влагу. Чрезмерное удаление костного во время распечатывания также следует избегать, так как интерстициальной жидкости / крови, как правило, затопить полость, когда были созданы большие отверстия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 9. Представитель результаты -. Гептанол потери слуха и восстановления означает, слуховые реакции ствола мозга (ABR) Пороги (дБ УЗД), представленный как функция PIP тонаЧастота. Измерения сгруппированы в соответствии с предварительной экспозиции (Черно-Control) и послеоперационный день (POD) 1, 7, 14 и (красный). Усы представляют SEM. Рисунок был вновь построенные по Стивенс и др. 2014 15 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 10. Представитель Результаты – Целевые кохлеарной повреждения после части экспозиции гептанол I. Изменения в калия Внутренней Rectifier (Кир) Канал 4.1 окрашивание в полоски vascularis (STV) ушей, обработанных гептанола и контроля уши. (А) Обычная Кир 4.1 окрашивания типичны управления уши сильным сродством strial клеток для Кир 4.1 (зеленый). (Б) Лечение уха на POD1. Большие вакуолизированных зоны ОВЦСоблегчили Кир 4.1 сродство видели в STV (стрелки) наряду с общим уменьшением в StV Кир 4.1 окрашивания интенсивности. Ядра контрастно пропидия йода (красный) (B). Масштабная линейка = 15 мкм. Рисунок был вновь построенные по Стивенса и др, 2014 15 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 11. Представитель Результаты – Целевые кохлеарной повреждения после экспозиции гептанол части II Изменения в спиральной связки (SL) из гептанола обработанной уха по сравнению с контрольными ухо.. (А) Обычная Кир 4.1 окрашивание (зеленый) в SL типичной управления ухо нормальное появление типа II спиральных связок фиброцитов (II). (B), т гептанолreated уха с выраженным снижением интенсивности Кир 4.1 окрашивания в области типа II спиральных связок фиброцитов, ядерной нарушения и конденсации хромосомного / пузырьков в соответствии с апоптоз (стрелки). Ядра контрастно пропидия йода (красный). Масштабная линейка = 15 мкм. Рисунок был вновь построенные по Стивенса и др, 2014 15 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 12. Представитель Результаты -. Восстановление кохлеарной интенсивности окрашивания после воздействия гептанола средняя относительная яркость Кир 4.1 окрашивание в виде функции суток после облучения. Относительная яркость рассчитывается как Кир 4.1 отражающий интенсивность под конфокальной микроскопии в гептанола леченияEd уши приняты как процент от то же самое в контрольных ушей. Данные Примечание POD14-28 объединяют в одной точке на кривой. Твердые круги представляют собой средние значения, а ошибка бары представляют стандартное отклонение от среднего. Существенное восстановление относительной яркости была продемонстрирована между POD 7 и более поздние сроки (т тест Стьюдента р <0,05, звездочка). Рисунок был вновь построенные по Стивенса и др., 2014 15 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Результаты протокола и представительств, описанные выше, были получены в модели CBA / CAJ мыши в том числе обоих полов. Это инбредных штамм хорошо известна как "хороший слух" стандарта и модели "нормального старения" в слух исследований. 16-23 Описание использования этого протокола в других моделях млекопитающих выходит за рамки этого текста. Читатель должен отметить, однако, что техника нанесения RWN предлагает несколько преимуществ для изучения млекопитающих внутреннее ухо. Из них наиболее заметным является то, что он избегает прямого нарушения деликатного анатомической структуры и биохимические градиенты, которые существуют в стенах слухового капсулы. Такие процедуры, как cochleostomy и имплантации инфузионных насосов имеют склонность непосредственно нарушать внутренние структуры уха, ведущие к постоянным пороговых сдвигов; факт, что должны быть приняты во внимание при анализе результатов. Нарушение кохлеарных боковых стеновых конструкций по инвазивным MethoDS может также ограничить использование ототоксических агентов, таких как фуросемид или гептанол, с удельной зоны воздействия ограничивается этом месте. 15,24 Альтернативные неинвазивные подходы, такие как транс-барабанной инъекций и парентерального введения были страдает от ненадежных результатов и / или системной токсичности в животной модели. Этот метод применения доказала, чтобы избежать обе эти недостатки, достижения уровня согласованности, приближающейся к более инвазивных методов, описанных выше.

Другие преимущества такого способа включают в его широкая применимость к ряду животных моделях и возможности включать в существующие лабораторной инфраструктуры. Что касается последнего, не специализированные реагенты или химикаты не требуются в стороне от выбранных ототоксичных агентов, анестетиков, анальгетиков и. Ототоксичен агенты обычно используют при фиксированной концентрации и смешивают в достаточно большом объеме раствора (5 мл) к последнему длительные периоды времени рассмотретьING каждое приложение использует около 10 мкл (у мышей). Таким образом, после первоначальной закупки материалов и инструментов, следователи относительно свободны от времени потребления приготовления раствора или частой замены материалов. Эта методика также предлагает сокращение времени операции, которые могут быть значительными по сравнению с процедур, связанных имплантации perilymphatic насосов инфузии или cochleostomies. При достижении уровня технических знаний, наш средний время завершения от первоначального разреза до закрытия был обычно 20 мин до 1,5 ч в зависимости от продолжительности воздействия требуемой для ототоксичен агента. Три или четыре операции могут быть легко завершены в течение одного дня, что позволяет повысить эффективность и повышенным потенциалом для получения успешных результатов. Как описано выше, этот метод может также быть легко применены к различным моделях грызунов в том числе мышей, крыс, морских свинок и песчанок.

Ограничения этого метода сосредоточены наумеренно крутой кривой обучения необходимо освоить его и снижение ожидаемых результатов, пока техническое мастерство не будет достигнута. Как будет обсуждаться более подробно ниже, небольшие погрешности в процессе хирургического доступа или недостаточной визуализации операционного поля почти всегда приводит к плохим прогнозом. Тонкие выводы, что новичок может не признают, такие как суб-миллиметра пузырьков воздуха блокирование доступа агента к круглой мембраны окна или межклеточной жидкости разбавления агента, потребуется время, чтобы оценить и развить навыки психомоторных, необходимые для их исправления. Тем не менее, при повторном выполнении процедуры эти препятствия легко преодолеть и составляют менее сложной технической задачей для исследователей, чем некоторые из вышеупомянутых инвазивных методов. Наконец, этот метод связан с относительной ограничением, что кохлеарный травмы могут быть вызваны только в одной точке во времени во время хирургической воздействия. Эту проблему можно решить в определенной степени, Путем заполнения RWn с губкой впитывающийся желатина, пропитанной агента, как было описано Хейдт др. 10 поглощаемого желатиновую губку будет поглощать с течением времени, но может позволить в течение более длительного периода экспозиции, чем это достижимо путем применения только водном растворе.

Для того, чтобы следователь в полной мере реализовать преимущества этой технологии и избежать любых ошибок, важно признать два важных элементов этой техники: 1) последовательно поддерживать визуализация среднего уха и списка Rating Watch и 2) способность удерживать операционное поле свободным от интерстициальной жидкости и / или крови. Для достижения первой из них, важность правильного головного держателя не может быть переоценена. Надежную фиксацию головы животного обеспечивает стабильную вид под микроскопом; важность которого становится легко очевидным, когда тонкий приборы резко меняется позиционирование структур при увеличении. Хороший чДержатель EAD, которые могут вращаться вокруг оси ростральной-хвостовой животного также способствует важные динамические изменения в соответствии следователя сайта. Часто, несколько миллиметров вращения вокруг этой оси может означать разницу между визуализацией списка Rating Watch и визуализации только ушные капсулы кости. Возможность постоянно менять вид также имеет первостепенное значение для обеспечения тканевой жидкости правильно удалены из глубины ниши, а также, что ототоксичен агент полностью удалена между приложениями, как описано в части 5. В нашем опыте, крови, конденсации или межклеточной жидкости который входит в среднего уха обладает способностью препятствовать всего эксперимента. Это не удивительно, так как небольшое количество ототоксичных агента применяется к круглым окном (~ 10 мкл) может быть легко разбавляется соприкосновения даже с небольшими объемами постороннего жидкости. По этой причине, тщательная хирургическая диссекция частям распечатывания барабанной буллы и тщательного preservatион стремянный артерии равносильны успешных экспериментальных результатов.

Если вышеуказанные важных шагов наблюдаются и ожидаемые результаты до сих пор не достигнуто, устранение неисправностей должны начаться. По нашему опыту, часто бывает полезно, чтобы выполнить пробные варианты двух процессуальных элементов. Во-первых, изменить частоту, с которой ототоксичен агент пополняется в круглом окне. В зависимости от используемого агента, общее время воздействия составляет от 30 мин до 1 ч, с полного капиллярного затекания и последующей заменой агента каждые 10 мин. Если подвергая на более короткие сроки, повышая общую экспозицию может позволить агент больше времени, чтобы диффундировать через мембрану круглого окна. Дополнительное воздействие и пополнение может также помочь избежать нежелательного разбавления ототоксичен агента кровью, конденсации или интерстициального, как описано выше. Внимание должно поддерживаться при использовании этого подхода, однако, поскольку она имеет тенденцию к увеличению риска непреднамеренныхLY ранив стремянный артерии и / или введения тканевой жидкости в списка Rating Watch.

Эта техника является существенным в том, что она предлагает исследований кохлеарной физиологии и патофизиологии. Это минимально инвазивная методика позволяет детально изучить деликатных биохимических процессов и был равносилен в продвижении нашего исследования, направленного на оценку кохлеарной регенеративный потенциал. 12,24 Это хирургический подход и экспозиция также воспроизводится в различных других методов ответвление, и успешные результаты использования этого Метод сообщалось в исследованиях кохлеарной имплантации стволовых клеток. 14 Многое остается неизвестным о улитки, однако, этот метод, наряду с более широким арсенал доступных для исследователей, поможет в сокращении этот пробел в знаниях.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health (NIH) Grant number: NIH P50DC00422 (H.L.); NIH R01DC12058 (H.L.). This work also benefitted from the South Carolina Clinical and Translational Research Institution (SCTR) Clinical and Translational Science Award (NIH/NCRR UL1RR029882). The funders had no role in study design, data collection, and/or analysis. The authors would like to thank Lonnie E. Brown Jr. for his artistic and graphic contributions.

Materials


 

1-Heptanol 98% Sigma-Aldrich H2805  PubChem Substance ID 24895536
250ML
Ketaset Injectable  Patterson Veterinary 07-803-6637  Concentrate 100mg/ml
(Ketamine HCl) 10ml Schedule CIII controlled substance
Anased Injectable Lloyd Laboratories NADA# 139-236 Concentrate 20mg/ml
(Xylazine)
Buprenex Injectable  Patterson Veterinary 07-850-2280  Concentrate 0.3mg/ml
(Buprenorphine HCl) 5 ampules per box Schedule CIII controlled substance
Betadine Skin Prep Solution Medline MDS093941  1 Quart screw top bottle
(Povidone-Iodine)
0.9% Sterile Saline Variable N/A For mixing solutions and injections
Table of Equipment, Surgical Instruments, and Specific Techniques
Material Name Company Catalogue Number Comments (optional)
Operating Microscope Carl Zeiss 32192
Controlled Acoustics Environment Sound Booth Industrial Acoustics Company N/A
Surgical Head Holder Custom Made –  Please see Figure 3
Medical University of South Carolina
Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75inch World Precision Instruments 555801L Maximum spread 20mm
Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder
90N Dental Belt Driven Hand Drill  Emesco N/A (Vintage Item)
Scalpel Handle Size6 Bard-Parker MEDC-011990
#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade  Bard-Parker SKU: 097-7215 50 Blades/Box
Via ACE Surgical Supply Code
Straight Tip Jewelers Forceps  Bernell MIL17304
Iris Scissors Curved Medline DYND04026 
Iris Scissors Straight Medline DYND04025 
Stevens Tenotomy Scissors Straight Medline MDG3222111 
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip MytaMed Item# 6.56.00 Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip MytaMed Item# 6.56.01
Kimwipes Delicate Task Wipers  Kimtech Science CODE 34155  White, Size 4.4×8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks.
House Ear Curette, 6” shaft, light angle Medline MDG0396486 
Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100 Medline IIS34201  Substitutions may be made
Cotton pellets #3 4mm Richmond Manufacturer Code 100108
ElectroSurgical Unit 100 E M/M Elmed List No. 52-5770 Bipolar and Monopolar Capable
1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5” length needle BD Product Number: 329410 Optional for delivery of Ototoxic agent
23G, blunt tip, 1” length needle Kendall Product Code 8881202397 For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery
Surgical Mask U-line S-10478
Exam Grade Nitrile Surgical Gloves U-line S-12549
Precision Hair Clippers Wahl N/A Multiple models may be substituted
5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1 13mm 3/8 circle needle Ethilon 1855G Substitutions may be made. 
Instant Sealing Sterilization Pouch Fisher 01-812054
Dry Sterilizer ROBOZ Germinator TM 500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kimura, R. S., Iverson, N. A., Southard, R. E. Selective lesions of the vestibular labyrinth. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 97, 577-584 (1988).
  2. Dodson, H. C. Loss and survival of spiral ganglion neurons in the guinea pig after intracochlear perfusion with aminoglycosides. Journal of neurocytology. 26, 541-556 (1997).
  3. Wanamaker, H. H., Gruenwald, L., Damm, K. J., Ogata, Y., Slepecky, N. Dose-related vestibular and cochlear effects of transtympanic gentamicin. The American journal of otology. 19, 170-179 (1998).
  4. Lee, K. S., Kimura, R. S. Effect of ototoxic drug administration to the endolymphatic sac. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 100, 355-360 (1991).
  5. Schmiedt, R. A., Okamura, H. O., Lang, H., Schulte, B. A. Ouabain application to the round window of the gerbil cochlea: a model of auditory neuropathy and apoptosis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 3, 223-233 (2002).
  6. Schmiedt, R. A., Lang, H., Okamura, H. O., Schulte, B. A. Effects of furosemide applied chronically to the round window: a model of metabolic presbyacusis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 9643-9650 (2002).
  7. Suzuki, M., Kikuchi, T., Ikeda, K. Endocochlear potential and endolymphatic K+ changes induced by gap junction blockers. Acta oto-laryngologica. 124, 902-906 (2004).
  8. Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. A method for intracochlear drug delivery in the mouse. Journal of neuroscience methods. 150, 67-73 (2006).
  9. Husmann, K. R., Morgan, A. S., Girod, D. A., Durham, D. Round window administration of gentamicin: a new method for the study of ototoxicity of cochlear hair cells. Hearing research. 125, 109-119 (1998).
  10. Heydt, J. L., Cunningham, L. L., Rubel, E. W., Coltrera, M. D. Round window gentamicin application: an inner ear hair cell damage protocol for the mouse. Hearing research. 162, 65-74 (2004).
  11. Palmgren, B., Jin, Z., Ma, H., Jiao, Y., Olivius, P. beta-Bungarotoxin application to the round window: an in vivo deafferentation model of the inner ear. Hearing research. 265, 70-76 (2010).
  12. Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Effects of chronic furosemide treatment and age on cell division in the adult gerbil inner ear. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 4, 164-175 (2003).
  13. Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Ouabain induces apoptotic cell death in type I spiral ganglion neurons, but not type II neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 6, 63-74 (2005).
  14. Lang, H., et al. Transplantation of mouse embryonic stem cells into the cochlea of an auditory-neuropathy animal model: effects of timing after injury. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 9, 225-240 (2008).
  15. Stevens, S. M., et al. Heptanol application to the mouse round window: a model for studying cochlear lateral wall regeneration. Otolaryngology–head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 150, 659-665 (2014).
  16. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hearing research. 130, 94-107 (1999).
  17. Hequembourg, S., Liberman, M. C. Spiral ligament pathology: a major aspect of age-related cochlear degeneration in C57BL/6 mice. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 2, 118-129 (2001).
  18. Ohlemiller, K. K., Gagnon, P. M. Apical-to-basal gradients in age-related cochlear degeneration and their relationship to ‘primary’ loss of cochlear neurons. The Journal of comparative neurology. 479, 103-116 (2004).
  19. Tadros, S. F., D’Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Apoptosis-related genes change their expression with age and hearing loss in the mouse cochlea. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 13, 1303-1321 (2008).
  20. Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Novel approach to select genes from RMA normalized microarray data using functional hearing tests in aging mice. Journal of neuroscience. 171, 279-287 (2008).
  21. Tang, X., et al. Age-related hearing loss: GABA, nicotinic acetylcholine and NMDA receptor expression changes in spiral ganglion neurons of the mouse. Neurosciences. 259, 184-193 (2014).
  22. Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 174, 171-176 (2014).
  23. Tadros, S. F., D’Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. Gene expression changes for antioxidants pathways in the mouse cochlea: relations to age-related hearing deficits. PloS one. 9, e90279 (2014).
  24. Lang, H., et al. Sox2 up-regulation and glial cell proliferation following degeneration of spiral ganglion neurons in the adult mouse inner ear. Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 12, 151-171 (2011).

Tags

Cochlear Cell DegenerationOtotoxic Agent DeliveryRound Window NicheCochlear InjuryAuditory PathophysiologyCochlear Cell RegenerationAnimal ModelHearing Loss

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Stevens, S. M., Brown, L. N., Ezell, P. C., Lang, H. The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration. J. Vis. Exp. (105), e53131, doi:10.3791/53131 (2015).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image