Interacciones intravital microscopía de leucocitos endoteliales y plaquetas de leucocitos en mesenterial venas en ratones
Summary
This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.
Abstract
Microscopía intravital es un método que se puede utilizar para investigar diferentes procesos en diferentes regiones y vasos en los animales vivos. En este protocolo, se describe la microscopía intravital de venas mesenterio. Esto se puede realizar en un corto período de tiempo con resultados reproducibles que muestran interacciones leucocito-endotelial in vivo. Se describe un entorno inflamatoria después del desafío LPS del endotelio. Sin embargo, en este modelo se puede aplicar diferentes tipos de afecciones inflamatorias, como la bacteriana, química o biológica e investigar la administración de fármacos y sus efectos directos sobre el animal vivo y su impacto en el reclutamiento de leucocitos. Este protocolo se ha aplicado con éxito a un número de diferentes tratamientos de ratones y sus efectos sobre la respuesta inflamatoria en los vasos. En este documento, se describe la visualización de los leucocitos y plaquetas mediante el etiquetado con fluorescencia éstos con rodamina 6G. Además, cualquier formación de imágenes específico puede ser performed usando dirigidos moléculas marcadas con fluorescencia.
Introduction
El propósito de este protocolo es para describir una técnica simplificada de la microscopía intravital de las venas mesenterio en ratones vivos para la observación directa de las interacciones leucocito-endotelial y de leucocitos de plaquetas bajo condiciones inflamatorias.
Microscopía intravital fue desarrollado para estudiar las interacciones leucocito-endotelial in vivo en condiciones inflamatorias 1,2, que no es trivial pero importante para la comprensión de reclutamiento de leucocitos inflamatoria y función. El método se describe en este protocolo fue desarrollado en base a las publicaciones previamente publicados. Similar a la visualización de la incorporación de plaquetas en un trombo crece 3 y en paralelo a lo que se ha publicado a principios 4, una vena mesenterio exteriorizada es examinado por microscopía de luz transmitida. Hay varios otros modelos de la microscopía intra vitales tales como el músculo cremáster de ratas 5 o el hígado del ratón y ratas 6.
Microscopía intravital de vena mesenterio se ha desarrollado y aplicado en los estudios previos por varios grupos. Hemos utilizado esta técnica para observar las diferencias en el reclutamiento de leucocitos entre los ratones de tipo salvaje y hydroxylase1 triptófano (TPH1) – / – ratones, que son deficientes de la serotonina no neuronal y comparado los resultados a ratones cuyos serotonina plaquetaria se farmacológicamente empobrecido por largo plazo aplicación de la recaptación de serotonina un inhibidor de la fluoxetina 7. También hemos examinado las interacciones leucocito-endotelial después del tratamiento con fluoxetina aguda 8.
En este protocolo nos centramos en la microscopía intravital de venas mesenterio, ya que este modelo se puede realizar de forma rápida, y permite mediciones válidas de las interacciones leucocito-endotelio y plaquetas de leucocitos. Esto es mucho más difícil y lleva mucho tiempo en la microscopía intravital de otros órganos, como los huesos, el hígado, la piel o músculo cremáster. El modol se describe aquí es ideal para la evaluación reproducible de la interacción célula-célula inflamatoria después de challengeing con un estímulo inflamatorio, como la inyección intraperitoneal de lipopolisacárido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe la preparación y el rendimiento de la microscopía intravital de las venas mesenterio de ratones in vivo. Este método nos da la oportunidad de observar las interacciones leucocito-endotelial y plaquetarios endotelial 11 directamente en el organismo vivo.
Como una respuesta temprana a la inflamación del endotelio se activa e interactúa con los leucocitos y las plaquetas que resulta en la rodadura, la adherencia y la transmigración 12. Pero…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).
Materials
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
