JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Dalbavansin için Başvuru sıvı mikrodilüsyon yöntemi<em> İn Vitro</emAerobik Olarak Büyüyen Bakterilerin> Duyarlılık Testi

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53028
, ,
1Laboratory Specialists, Inc, 2Clinical Microbiology, Actavis plc

Summary

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Abstract

Antimikrobiyal duyarlılık testi (AST), çeşitli bakterilere karşı antimikrobik maddelerin in vitro aktivitesini değerlendirmek için gerçekleştirilmektedir. Minimum inhibe edici konsantrasyonlar (MIC) olarak ifade edilmiştir AST sonuçlar, direnç gelişme antimikrobiyal gelişimi ve izlenmesi için araştırma ve antimikrobiyal tedavisi rehberlik için klinik ortamda kullanılır. Dalbavansin Gram-pozitif organizmaların neden olduğu akut bakteriyel deri ve deri eklerinin enfeksiyonlarının tedavisinde Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından Mayıs 2014 yılında kabul edildi yarı sentetik lipoglycopeptide antimikrobiyal ajandır. Mevcut anti-stafilokok tedavileri karşısında Dalbavansin avantajı, haftada bir dozlama için izin veren, uzun yarılanma ömrü vardır. Dalbavansin, koagülaz-negatif stafilokoklar (hem metisiline duyarlı S. aureus [MSSA] ve metisilin dirençli S. aureus [MRSA] dahil) Staphylococcus aureus karşı aktiviteye sahiptir <em> Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus grubu, β-hemolitik streptokoklar ve vankomisin duyarlı enterokok. Plastik maddenin yapışmasını azaltmak için stok solüsyonları ve polisorbat 80 (P80) hazırlarken diğer yeni lipoglycopeptide maddeleri, CLSI ve ISO suyu duyarlılık test yöntemleri optimizasyonu benzer şekilde, bir çözücü olarak dimetil sülfoksit (DMSO) kullanımını içerir. Klinik çalışmalarda ve Dalbavansin ilk gelişimi sırasında önce duyarlılık çalışmaları P-80 kullanılması ile gerçekleştirildi ve MIC sonuçları 2-4 kat daha yüksek ve daha yüksek bir MIC Benzer sonuçlar agar dilüsyon duyarlılık yöntemi ile elde edilen olma eğilimindeydi değildi. Dalbavansin ilk olarak 2005 yılında CLSI sıvı mikrodilüsyon yöntemi tablolara dahil ve DMSO ve P-80 kullanımını açıklamak için 2006 yılında değiştirilmiştir. Lapa mikro-seyreltme burada gösterilir (BMD) prosedürü Dalbavansin özgüdür ve adım adım detaylı ya da elverişli olan, CLSI ve ISO yöntemlere uygun olarak birKritik adımlar bize netlik eklendi.

Introduction

Dalbavansin Gram-pozitif organizmaların 1 kaynaklanan akut bakteriyel deri ve deri eklerinin enfeksiyonlarının tedavisinde Mayıs 2014 yılında FDA tarafından onaylanmış bir yarı sentetik lipoglycopeptide olduğunu. Bir video formatında bu yöntemi ayrıntılı birincil hedefi doğru ve tekrarlanabilir dalbavansin duyarlılık sonuçlarının test edilmesi ve raporlanması için klinik laboratuvar ve araştırma bilim adamları açık bir rehberlik sağlamaktır.

Ticari yöntemlerle antimikrobiyal bir madde MIC tespiti rutin patojenik bakterilere karşı bir ajan, in vitro etkinliğinin değerlendirilmesi için klinik laboratuarlarda gerçekleştirilir. CLSI ve ISO 2,3,4 tarafından tavsiye edilen Burada anlatılan yöntem sıvı mikrodilüsyon yöntemidir. Ve disk difüzyon ve agar dilüsyon yöntemleri (Bu yayının anda) ticari duyarlılık yöntemleri henüz mevcut değildir dalbavansin beri halen f tavsiye edilmezveya dalbavansin, referans suyu seyreltme yöntemleri 12,14 mevcut akım seçenekleridir. Bu referans yöntem ticari olmayan ve FDA laboratuvar geliştirilen testte (LDT) için düzenleyici gerekliliklere uymak zorundadır hasta testi için bu yordamı kullanabilirsiniz ABD'de in vitro diagnostik yöntem, klinik laboratuvarlar temizlenir gibi. Bu dalbavansin kullanım arttıkça, daha fazla laboratuvarlar bu bileşiği test etmek için bir ihtiyaç olacağı tahmin edilmektedir. S. dalbavansin karşı hassasiyetlerinin belirlenmesi için bir vekil olarak vankomisin testi aureus 5 onaylanmıştır. Bununla birlikte, dalbavansin vankomisin ara madde S. karşı etkin olabilir aureus (VISA) ve bu nedenle, klinisyenlerin dalbavansin MIC sonuçlarını isteyebilir. Buna ek olarak, diğer bakteri türleri için MIC sonuçları istenebilir.

S. karşı Dalbavansin FDA duyarlı kesme aureus ≤0.12 ug / ml'de kurulmuştur. FDA atanmış yalnızca susceptiÇünkü dirençli izolatların verilerinin eksikliği ble kategorisi. Vahşi tip S. arasında, normal dağılım MIC aureus 0.06 ug / ml 'lik bir açık modal MIC ug 0,03-0,12 arası / ml vardır. Sözü geçen yöntemin farkı MIC sonuçları küçük bir farklılık, ±, bir seyreltme doğasında BMD değişime ek olarak, potansiyel olarak duyarlılık oranları üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Diğer lipoglycopeptide ajanlara benzer 6, dalbavansin duyarlılık testi sonucu zor olabilir Çözünürlük ve molekülün nispeten büyük bir boyutu ve bağlanma özellikleri 7,8,9 arasında. Burada tarif edilen bir referans BMD yöntemi çözülmeyen maddeler ve / veya lipoglycopeptide maddeler için benzersiz olan iki spesifik adımları içerir: (1) Nihai MIC panelinde Stok çözeltilerin hazırlanması ve% 0.002 P-80 (2) ek olarak DMSO kullanımı dilüsyonları. Bu videoyu yayının amacı dalbavansin BMD yöntemi ve Istenen özelliklere netlik sağlamak içinLly doğru ve tekrarlanabilir MIC sonuçları sağlamak için, bu önemli adımlar odaklanın.

Protocol

Antimikrobiyal duyarlılık 2, 3, 4 referans sıvı mikrodilüsyon yöntemi tüm detaylar için CLSI belgeler M7-A10 ve M100-S25 ve / veya ISO / FDIS 20776-1 bakın referans yöntemleri bazı seçenekleri için izin: Not. inokulum hazırlama ve MIC paneli üretimine özel prosedürler aynı sonuca ulaşmak için. Burada açıklanan yöntem, bir antimikrobiyal madde, Dalbavansin ilişkindir ve bazı adımlar referans prosedürü yapılabilir potansiyel çeşitli yollardan temsil eder. (Biyogüvenlik seviye 2 ile uyumlu) uygun güvenlik önlemleri 10 kullanılmalıdır. Bu Video yayın amacıyla kullanılan MIC panel format Tablo 1 'de gösterilmiştir. 1. Mağaza dalbavansin Toz Olmayan bir defrost dondurucuda bir kurutulmuş ortamda -20 o C'de tanı dereceli dalbavansin tozu, mağaza aldıktan sonra. Kullanımdan önce, toz dengelenmeye olmalıdıraçmadan önce RT ulaşır. 2. MIC Panel dilüsyonlarının hazırlayın Steril cam ya da plastik tüplerde, temiz (saf), DMSO Dalbavansin hiç daha yüksek 1600 ug / ml stok çözelti hazırlayın ve -60 ° C'nin altında veya gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de işleme ve hazırlama deposu aynı gün kullanmak olmayan bir buz çözme dondurucu. Toz ağırlığında olduğunda toz ile alınan belgelerde verilen olarak dikkate Dalbavansin potens al, (örneğin, 800 ug / ml stok hazırlanması için Denklem 1 e bakınız). Steril cam ya da plastik tüplerde saf DMSO ile Tablo 2'de kolon 1 e ("Kaynak Konsantrasyon") 'de gösterildiği gibi şemaya benzer hazır seyreltme ile seyreltilir. Seyreltici ve birinci tüp başlangıç ​​dalbavansin stok eklemek için başka bir pipet ölçmek için, bir pipet kullanın. Sonraki her dalbavansin stok konsantrasyonu için yeni bir pipet kullanın. 100X son MIC paneli concent hazırlayınsaf DMSO ile tayın seyreltileri (ara konsantrasyonlar). Sütun 2, Tablo 2-4 de gösterildiği gibi, (yapılacak MIC panelleri sayısına bağlıdır kullanılacak hacim) istenen ara madde konsantrasyonu elde etmek için kaynak ve DMSO, uygun hacimleri birleştirir. % 0.004 P80 hazırlayın: 4.9 ml dH 2 O 0.1 ml P80 eklenerek% 2 P80 taze çalışma stok çözeltisi hazırlayın Hazırlık aynı gün 0.22 mikron filtre ve kullanım çözeltisi geçirilerek sterilize edin. (CAMHB içinde 149,7 ml örneğin, 0.3 ml% 2 P80) 500 seyreltme% 2 P80: 1 yaparak% 0.004 P80 seyreltici hazırlayın. Bundan başka Aşama 1 2,2 'da hazırlanan ara konsantrasyonları sulandırmak 100% 0.004 ile takviye edilmiş bir katyon arındırılmış, Mueller Hinton suyu (CAMHB) içindeki bir (h / h) polisorbat-80 (P-80), P-80 ve / veya LHB (streptokok için) ilave 2 seyreltme: iki nihai konsantrasyonda aşılama (adım 4.3) ilave bir 1 sonuçlanacaktır. Tablo 2'de sütun 6 ve 7 görün </st> Rong. 3. MIC Panelleri hazırlayın MIC panelin uygun oyuklara adım 2.3 hazırlanan her dalbavansin çözeltisi 50 ul koyun ve (de büyüme kontrolü), yalnızca bir kuyuda ortamı içerir. Steril uçları bir çok kanallı pipet bu aşama için kullanılabilir. Hemen panelleri kullanın ya da plastik torbalarda plastik film, yer mühür ve hemen ≤-20 o C (tercihen ≤-60 o C de) ihtiyaç duyulana kadar az olmayan bir defrost dondurucuda yerleştirin. Donmuş paneller kullanılması halinde, mühürleri kaldırmak ve (iyi içeriği çözülmüş kadar) Panel aşılamadan geçmeden önce 15-30 dakika süreyle laboratuvar bankta tek tek panelleri yerleştirin. 4. MIC Panelleri inoküle Saflık ve Kurulum Koloni Sayısı gerçekleştirin Bir 18-24 saat kan agar veya diğer non-selektif agar plakasından birkaç iyi izole edilmiş koloniler seçin. 1-5 ml CAMHB veya s steril döngü veya bez ve transferi ile her koloninin üst dokununbulanık oluncaya dek aline 0,5 McFarland standart eşdeğerdir. 0.5 McFarland veya fotometrik bir cihaz ile karşılaştırma yapılarak bulanıklık değerlendirin. CAMHB içinde 100 (100 ul, 10 ml CAMHB da): preparatın 15-30 dakika içinde, inokulum 1 seyreltin. S. hariç Dalbavansin karşı test Çoğu bakteriler için pneumoniae, bu seyreltme 5 x 10 5 CFU / ml'lik bir son konsantrasyonda (kabul edilebilir aralık 2-8 x 10 5 CFU / ml) sağlar. S. pneumoniae, 0.5 McFarland türbidite karşılaştırılmasına dayanarak bakteri konsantrasyonu, bu nedenle, (10 mi CAMHB +% 10 + LHB içine 400 ul) inokulum 1:25 seyreltin, daha az, tipik olarak. Aşı hazırlama sonra 15 dakika içerisinde, steril uçları kullanarak bir çok kanallı pipet bu aşama için kullanılabilecek adım 3'te hazırlanan MIC panelin (sterilite kontrolü hariç kuyu) her nihai bir inokulum 50 ul aktarma. Bir saflık kontrolü yapıntransfer ve iyi bir seçici olmayan agar (% 5 koyun kanı ile, örneğin, triptikaz soya agar) steril döngü kullanarak pozitif büyüme denetimden 1-10 ul kısım yayarak. (: 1000 seyreltme 1) tuzlu su 10 ml büyüme kontrolü de bir tek kanal pipet steril ucu transfer 10 ul çıkararak Kur koloni sayısı. Farklı yönlerde iki kez karıştırın ve uygun bir selektif olmayan agar ortamında (örneğin, triptikaz soya,% 5 koyun kanı agar) ve steril bir çerçevenin bulunduğu tüm agar yüzeyi üzerine yayılmış, tekrar için tek bir kanal pipet steril ucu ile 100 ul aktarma inokulum (1:10 seyreltme) eşit dağılımı sağlamak için. 5. inkübe MIC Paneller, Koloni Sayımı ve Saflık Tabaklar Plastik bantla veya kuluçka önce dar plastik kapaklı, plastik bir torba içinde en fazla 4 panellerin her MIC panelini veya yığını Seal. Alternatif olarak, t boş MIC paneli yerleştirmeken fazla 4 MIC panellerinin yığınının op, bir plastik kap içinde nemli bir kağıt havlu koyun, plastik kap ve güvenli kapaklı yakın kapta yer MIC panelleri. 16-20 saat (stafilokoklar ve enterokoklar) ile inokülasyon 30 dakika içinde 20-24 saat (streptococci) için 35 ° C ± 2 ° C 'de ortam hava kuluçka makinesi içinde MIC panelleri inkübe edin. % 5 CO2 inkübatöründe inkübe streptokoklar dışında aynı koşullar altında, koloni sayımını ve saflık inkübe edin. 6. MIC okuyun ve Koloni Sayım Plakası; Saflık Plakası Kontrol Tamamen çıplak gözle tespit edilen kuyulardan bakteri üremesini engeller düşük konsantrasyon olarak MIC okuyun. Koloni sayımı plaka üzerinde koloniler sayın. Seyreltme faktörü (1: 10,000), her bir koloni çarpın (örneğin, 50 koloni 5 x 10 5 CFU / ml'ye eşittir). Kabul edilebilir bir aralık 20-80 kolonidir (2-8 x 10 5 CFU / ml) ve beğenme olarak kullanılanximate kılavuz. Saflık plakasını kontrol edin. Tüm koloni aşama 4,1 kullanılan koloniler benzer ise, o zaman aşı saf olarak kabul edilebilir. Mevcut başka bir koloniler varsa bir kirletici MIC panelinde mevcut olması ve test tekrar edilmelidir, daha sonra bir potansiyel vardır. 7. Kontrol Kalite Kontrol Sonuçları. CLSI kalite kontrol suşları beklenen aralıkları için Tablo 3'e bakınız. Sadece kalite kontrol organizmanın (ler) için dalbavansin MIC sonuçlar beklenen kapsama alanında izolatları ise testin sonuçlarını rapor. ≥0.25 ug / ml'lik bir MIC herhangi bir klinik S. elde edilirse aureus dalbavansin MIC testi tekrarlamak ve / veya doğrulama için bir referans laboratuvarına gönderin, izole.

Representative Results

Standardize MIC yöntemler direnç gelişimi, çeşitli antimikrobiyal gözetim programlarının önemli bir hedefi izlemek için gereklidir. 2011-2013 yılında Avrupa ve ABD'de toplanan izolatlar için dalbavansin MİK sonuçları S.aureus% 99.9 ve streptokok% 100 (Tablo 4) için <0.25 mg / ml idi. Taze (mühürlü) DMSO, QC suşları S. dalbavansin BMD MİK üçlü test kullanmanın önemini değerlendirmek için aureus ATCC 29213 ve E. ve ATCC 29212 faecalis S. test çoğaltmak pneumoniae ATCC 49619 son kullanma tarihini ve 2 yıl ve daha önce kullanılmış olan 1 L'lik bir şişe sızdırmaz ampuller, (1) DMSO (2) DMSO kullanılarak gerçekleştirilmiştir (3), aynı 1 L bir DMSO alikosu kullanımdan önce 72 saat için bir açık çanak içinde kalmasına izin verilen bir şişe (Örnek 2). Her üç DMSO örnekleri ile yapılan paneller kullanılarak dalbavansin MIC sonuçları benzer ve w vardıolarak kabul edilebilir bir kalite kontrol aralıkları IŞIN (Tablo 5). P-80 ilave plastik olmadan stok çözeltisi maruz kaldıktan sonra dalbavansin aktivite kaybı de 7 belgelenmiştir. 2 ek çalışmalar, başlangıç ​​ve ara stok çözeltileri (Tablo 6), P-80 eklenmesi ve başlangıç ​​ve ara Stok çözeltilerin hazırlanması için, cam veya plastik boruların kullanımı (Tablo 7) üzerinde bir etkisi yoktu dalbavansin MIC sonuçları. Üç üreticilerin polipropilen ve polistiren levhalar (Tablo 7) kullanıldığı zaman dalbavansin MİK sonuçları üzerinde hiçbir etkisi yoktu. Streptokok test sıvısı ortamı içinde lize at kanı varlığı P-80 7, 8 ile kıyaslanabilir bir yüzey aktif madde benzeri bir aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. Streptokoklar için dalbavansin referans yöntem her ikisi de P-80 ve lize at kanı dahil etmez ,Bununla birlikte, stafilokok ve enterokoklar farklı olarak, streptokoklar için dalbavansin MIC sonuçları ve P-80 ilavesi olmadan (+/- 1 seyreltme içinde) benzerdir. Daha önce sunulan ve Şekil 1 'de gösterilmiş olduğu gibi, dalbavansin agar seyreltme (AD), MIC'ler 2-8 kat daha yüksek akım BMD referans 12, 13, 14 ile karşılaştırıldığında. BMD,% 0.002 ilave aksine, P-80, tipik olarak değil MIC 12 sonuçları dalbavansin AD etkiler. Denklem 1:. 800 ug / ml dalbavansin çözelti 25 ml dalbavansin Stok Çözeltisinin Hazırlanması Hazırlama aşamalarının örneği. AD dalbavansin ve Vankomisin BMD Şekil 1. karşılaştırılması. Dalbava karşılaştırıldığında çalışmanın sonuçlarıprogramcısı tarafından araya ve vankomisin BMD basıp Gram-pozitif bakteri izolatları için AD MİK sonuçları. Ortalama (A) dalbavansin ve (B) 15 Staphylococcus aureus, 8 koagülaz negatif stafilokok (KNS), 5, Enterococcus faecalis ve 14 Streptokoklar için ug / ml Vankomisin sıvı mikrodilüsyon ve Agar Sulandırma MIC Sonuçları (Grup A, B, ve C). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 Dal 0.03 DAL; 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. B DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 Dal 0.03 DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. C DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 Dal 0.03 DAL 0.06 DAL0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. D DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 Dal 0.03 DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. E DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 Dal 0.03 DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 </td> DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. F DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 Dal 0.03 DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. G DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 Dal 0.03 DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 00,5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. H DAL 0.002 DAL 0.004 DAL 0.008 DAL 0.015 Dal 0.03 DAL 0.06 DAL 0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. DAL Dalbavansin <td> Konsantrasyonlar 50 ul / oyuk aşılamadan sonra ug / ml olarak ifade edilmiştir Tablo 1. MIC Plaka Biçimi. Bu, video yayında, örnek olarak kullanılan dalbavansin seyreltici ve pozitif kontrol kuyuları 96 kuyucuklu plak format gösteren Yer 1 2 3 4 5 6 7 8 Kaynak Kons. (ug / ml) Hacim Kaynak (ml) Hacim DMSO (mi) Intermediate Kons. DMSO (ug / ml) Ses Intermediate Kons. (mi) Cilt CAMHB +% 0.004 P80 * (ml) 2X Kons. 1 sonra: CAMHB 100 seyreltme (ug / ml) Final Panel Kons. Mesaj aşılama (ug / ml) 800 1.0 1.0 400 0.02 1.98 4 2 400 0.5 0.5 200 0.02 1.98 2 1 400 0.5 1.5 100 0.02 1.98 1 0.5 400 0.5 3,5 50 0.02 1.98 0.5 0.25 50 0.5 0.5 25 0.02 1.98 0.25 0.125 50 0.5 1.5 12.5 0.02 1.98 0.125 0.06 50 0.5 3,5 6.25 0.02 1.98 0.06 0,03 6.25 0.5 </td> 0.5 3.13 0.02 1.98 0,03 0.015 6.25 0.5 1.5 1.5 0.02 1.98 0.015 0.008 6.25 0.5 3,5 0,8 0.02 1.98 0.008 0.004 0,8 0.5 0.5 0.4 0.02 1.98 0.004 0.002 Bu tablo CLSI M100-S25, Tablo 8B 3 modifiye edilmiş Suda çözünmez Antimikrobiyal Ajanların seyreltiler hazırlanarak Tablo 2. Şema Broth seyreltileri Hassasiyet Testinde Kullanılacak. Dalbavansin çalışma çözümleri ve seyrelticilerin Birimleri nihai MIC hazırlanması için0,002-2 ug / ml dalbavansin çözümler. Kalite Kontrol Gerginlik Beklenen dalbavansin MIC (ug / ml) S. aureus ATCC 29213 0,03-0,12 E. faecalis ATCC 29212 0,03-0,12 S. pneumoniae ATCC 49619 0,008-0,03 Önerilen suşları için Kalite Kontrol suşlar 3, 11. CLSI kalite kontrol sonuçları için Tablo 3. Beklenen dalbavansin MIC Sonuçlar doğru metodoloji doğrulamak için klinik izolatlar ile birlikte test edilecek ABD ve Avrupa 2011-2013 Surveill (her MIC at Number) dalbavansin MIC Sonuçlar Tablo 4. Dağılımıance Çalışması 15. In vitro aktivite geçerli Dalbavansin bir göstergesi olarak son klinik izolat yayımlanmış bir çalışmanın dalbavansin MİK sonuçları. # Yalıtmak Dalbavansin MIC (ug / ml) DMSO 1 DMSO 2 DMSO 3 S. aureus ATCC 29213 0.12 0.06 0.06 0.12 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 E. faecalis ATCC 29212 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 <em> S. pneumoniae ATCC 49619 0.015 0.015 0.015 0,03 0.015 0.015 DMSO 1 = Açılmamış alev 10 ml ampul kapalı DMSO 2 = Sık açıldı 1L şişe DMSO 3 = Sık açıldı 1L şişe – 72 saat boyunca çıplak beher bankta oturdu Tablo 5. dalbavansin MIC sonuçları 3 Kaynaklardan DMSO DMSO stok ve Aramadde seyreltileri Hazırlama kullanılarak (ug / ml). Dalbavansin stoku ve ara-ürün seyreltileri hazırlanmasında, farklı DMSO çözücüler kullanılarak etkisini karşılaştırıldığında dalbavansin MIC çalışmanın sonuçları. Numarasını yalıtmak Numarasını Çoğalt Dalbavansin MIC (ug / ml) DMSO içinde DALB ağırlık / P80 DALB w DMSO içinde o P80 / S. aureus ATCC 29213 1 0.06 0.06 2 0.06 0.06 3 0.06 0.06 4 0.06 0.06 S. aureus, klinik DP80-002SA 1 0,03 0,03 S. aureus ATCC 700699 1 0.5 0.5 S. pneumoniae ATCC 49619 1 0,03 0.015 2 0,03 0.015 3 0,03 0.015 4 0,03 0.015 S. pyogenes Klinik: DP80-004PY 1 0.015 0.015 DP80-005PY 1 0,03 0,03 DP80-006PY 1 0,03 0.015 DP80-007PY 1 0.06 0,03 DP80-008PY 1 0,03 0.015 S. Klinik agalactiae'de: DP80-009AG 1 0.06 0.12 DP80-010AG 1 0.06 0,03 DP80-011AG 1 0.06 0.06 DP80-012AG 1 0.06 0.06 S. dysgalactiae Clinical DP80-013DY 1 0,03 0,03 S. pneumoniae klinik: DP80-014SP 1 0.06 0.06 DP80-015SP 1 0,03 0,03 DP80-016SP 1 0,03 0,03 DP80-017SP 1 0.06 0.06 Ve% 0.002 olmadan DMSO Stok ve Orta Düzey Seyreltiler Hazırlık kullanarak Tablo 6. dalbavansin MIC Sonuçları P-80.% 0.002 P-80 stok ve ara seyreltilerini dalbavansin ekleyerek etkisini karşılaştırıldığında dalbavansin MIC çalışmanın sonuçları. Izole etmek Numarasını Çoğalt </td> Stok Seyreltme Tüpler Mikrotiter Plate (Plastik Türü) Poli-propilen, Greiner Polistiren Bardak Plastik Plastik 1saat Plastik 1saat / Intermediate 1 saat Greiner Corning Nunc S. aureus ATCC 29213 1 0.06 0,03 0,03 0,03 0.06 0,03 0.06 0,03 2 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0.06 3 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 E. faecalis ATCC 29212 <td> 1 0.06 0.06 0.06 0.06 0,03 0,03 0.06 0,03 2 0.06 0.06 0.06 0.06 0,03 0,03 0.06 0,03 3 0.06 0.06 0.06 0.06 0,03 0,03 0.06 0,03 S. pneumoniae ATCC 49619 1 0.015 0.015 0.015 0.015 0.008 0.008 0.008 0.008 2 0.015 0.015 0.015 0.015 0.008 0.015 0.008 0.008 Cam şişe yapılan cam = stoğu, ara madde konsantrasyonunu yapmak üzere hemen kullanılmıştırHemen kullanılan plastik tüpler, s suyu dilüsyonları yapmak. Hemen kullanılan plastik bir santrifüj tüpüne yapılan ilk = plastik stok sıvısı seyreltiler yapmak üzere hemen kullanılmıştır plastik tüpler, içinde bir ara madde konsantrasyonları hazırlamak için. Plastik bir santrifüj tüpüne yapılan plastik 1 hr = stoğu daha sonra suyu içinde konsantrasyonları hazırlamak için hemen kullanılmıştır plastik tüpler, içinde bir ara madde konsantrasyonlarını yapmak için kullanılan 1 st için tezgah üzerinde bekletin. Plastik bir santrifüj tüpüne yapılan plastik 1 saat / Aramadde 1 hr = stoğu daha sonra, plastik borular içinde bir ara madde konsantrasyonları hazırlamak daha sonra suyu içinde konsantrasyonları hazırlamak için kullanılan 1 st için tezgah üzerinde bekletilir için kullanılan 1 st için tezgah üzerinde bekletin. Plastik ve Cam Tüpler ve MIC Levha Plastik Türleri Stok Seyreltiler Hazırlık kullanarak Tablo 7. dalbavansin MIC Sonuçları. O Sonuçlarfa dalbavansin da mikrotitre plakaları için farklı kaynaklardan ve plastik türlerini kullanarak etkisini stok çözelti hazırlamak ve ne zaman plastik ya da cam tüpler kullanarak etkisini karşılaştırıldı MIC çalışması.

Discussion

Dalbavansin MIC testi için hazırlarken aşağıdaki yöntem detayları ek hususlar için sunulmuştur. Antimikrobiyal maddeler sayısı (yani., Tek başına ya da çok sayıda dalbavansin maddeler) ve bakteri türleri, test edilecek test edilecek MIC panelinin tasarımı bağlı olacaktır. Dalbavansin konsantrasyonları en az bir QC suşu için beklenen test edilecek tüm bakteri türlerinin ve dilüsyonlarının tüm aralığı için yorumlayıcı kesme noktalarını içermelidir. Antimikrobiyal seyreltme serisi, antimikrobiyal maddeler ve / veya / plaka ve inokülasyon yöntemini yalıtır sayısına bağlı olarak satırlar veya sütunlar ya organize edilebilir. Dalbavansin tozu ve suyu hacmi optimal miktarlarının üretildiği ve atık az olduğundan emin olmak için hesaplanmalıdır. Bu yayında kullanılan Örneğin, cildi, iki MIC panellerin hazırlanması dayanmaktadır. Katyon düzeltilmiş Mueller Hinton suyu adama göre hazırlanan ve otoklavlanmalıdırolarak üreticinin talimatları ve medya sterilite doğrulandı. MIC panel yapılmıştır ve hazırlık aynı günde veya kullanılmış, uygun kalite kontrol organizmalar ve gelecekte kullanılmak üzere dondurulabilir saklanan doğrulanmış paneller ile test edilebilir edilebilir. Bu prosedür boyunca steril teknikleri kullanmak önemlidir.

Koloni sayıları ile inokulum konsantrasyonu doğrulanması için kesin kriter yoktur. Koloni sayımları aşama 4,2 gerçekleştirilen seyreltme adımı doğrulamak için periyodik olarak test ve / veya her tür için, başlangıçta kontrol edilebilir. Bu 0,5 McFarland standardına geçerliliği de E. ile rutin olarak kontrol edilmesi önemlidir 4.5 adım e benzer bir prosedür kullanılarak E. coli ATCC 25922. Sonuçlar 1-2 x 10 8 CFU denk değilse / ml, yeni 0,5 McFarland standart alınmalıdır. MIC kuyulardan koloni sayımları kabul edilebilir aralığın dışında ise (klinik izolat (ler) için 2-8 x 10 5 CFU / ml ve MIC sonuçları inci değişirE beklenen normal dağılım (örn. 0,03-0,12 ug / S. aureus için ml) ve / veya kalite kontrol izolatı (ler) için MIC sonuçlar beklenen aralıkların dışında, doğrulama testleri gereklidir ve yöntem değiştirme garantili olabilir. Bir valide 0,5 McFarland standart koloni sayısı (ler) tekrar için kullanılan ileri sürülmektedir ve sonuçları beklenen sonuçların dışında yine eğer, adım 4.2 gerçekleştirilen şekilde aşı seyreltme buna göre ayarlanmalıdır ve MIC tekrarladı. Koloni sayımı işlemi mutlaka kirletici organizmaların düşük konsantrasyonlarda tespit olmayabilir seyreltilmiş hacmi kullanır çünkü koloni sayımı yapılır bile saflık kontrolü gerekli olduğunu unutmayın.

MIC testi geçerli sayılabilmesi için, kabul edilebilir bir büyüme de büyüme kontrolü yapılmalıdır. Dalbavansin karşı test edilecektir çoğu bakteriler için (yani., Stafilokoklar, streptokoklar ve enterokoklar, büyüme bir düğme (genellikle> 2 mm) ve daha az fr olarak görülecektirequently büyüme kuyuda bulanıklık olarak görünebilir. Konsantrasyonları arttıkça etkisi sondaki görülebilir bazı antimikrobiyal ajanların aksine, dalbavansin uç noktaları genellikle iyi tanımlanmıştır. Sürece kuyularda büyümeyi ayırt yeteneği hiçbir uzlaşma olmadığı için dalbavansin içeren plakalar okumak için kullanılan olabilir okuma mikrodilüsyon testleri kolaylaştırmak amacıyla çeşitli görüntüleme cihazları vardır.

Protokol içindeki kritik adım Dalbavansin ve P80 eklenmesi çözünürlük ile ilişkili prosedür parçaları ile ilgilidir. Bu besiyeri seyreltmeleri hale getirmek için bu DMSO çözücü olarak kullanılır ve bu ara ürün konsantrasyonları DMSO içinde hazırlanmaktadır, kullanılan Dalbavansin maksimum konsantrasyonu büyük olmayan 1.600 den ug / ml olması özellikle önemlidir, böylece MIC nihai DMSO konsantrasyonu, Panel kuyuları% 1 daha büyüktür. DMSO higroskopiktir ve bu nedenle, DMSO eski şişelerin kullanımı considerat oldudalbavansin çözünürlüğü ile ilgili olarak iyon. Kalite kontrol suşları ile küçük BMD çalışma bu göstermiştir Ancak, (sonuçlar bölümüne bakınız) önemli bir değişken olarak değil, bu DMSO yeni veya yakın zamanda açılan şişe kullanmak iyi bir uygulamadır. Bu P80, ilaç seyreltme hazırlama son aşamada çorbasına eklendiği de önemlidir ve de MIC% 0.002 nihai konsantrasyondadır.

BMD prosedürü buraya dahil iyi Dalbavansin ve P-80 konsantrasyonları iki kez nihai konsantrasyon ve 50 ul inokulum ek olarak / de öylesine nihai hacim / kuyu 100 ul olduğunu 50 ul / kullanarak MIC panellerin hazırlanmasını kullanır. Tek MIC paneli biçimi, hem S. test için üretilecek için bu yöntem veriyor aureus ve S. pneumoniae lize at kanı inokulum eklenebilir, çünkü. 100 ul / oyuk ile 10 ul ilave kullanarak MIC panellerin hazırlanması için alternatif yöntemler / göz tarif edilmektedirCLSI ve ISO işlemleri.

S. dalbavansin duyarlı kesme noktası aureus ≤0.12 ug / ml (FDA paket eki) 'dir. Son gözetim de gösterildiği gibi, izolatların çoğunluğu 0,06 ug / ml 15 seviyelerinde dalbavansin ile inhibe edilir. Kapat modal MIC duyarlı kesme, yöntem farklılıkların sonucu olarak MIC herhangi bir değişiklik duyarlılık oranları etkileyebilir. Dalbavansin için BMD prosedürü (bazı benzersiz adımları içerdiğinden, özellikle de MIC stoklar ve orta sulandırılmış ilaç ve% 0.002 P80 hazırlanması DMSO kullanımı, bu yöntem tam olarak takip etmesi zorunludur. S. aureus QC organizma 0.06 mg / ml çok açık dalbavansin modal MIC ile (ATCC 29213), yöntem varyasyon iyi bir göstergesi olmuştur ve BMD yöntemini doğrulamak için rutin olarak kullanılmalıdır. MIC sonuçları 0.03-0.12 ug beklenen yelpazesi ile iseniz / ml, ama ya düşük ya da HIG için trend olanBu aralığın h tarafı, yöntemin ayrıca doğrulama garanti edilir.

% 0.002 P80 eklenmesi tüm ilgili gram-pozitif organizmalar için önerilir (staphylococcci, enterokoklar ve streptokoklar). Bununla birlikte, bu bağlayıcı, anti onun P-80 nisbetle benzer hareket at kanı lize gösterilmiştir dikkat çekicidir yeteneği ve + LHB dalbavansin streptokoklar MIC sonuçlarına ek bir etkiye sahip CAMHB P-80 eklenmesi bu.

Orada test Dalbavansin hiçbir disk difüzyon yöntemi şu anda olduğundan ve yoksul KMY korelasyon ve AD sonuçları, AD yöntemi kullanılarak Dalbavansin duyarlılık testi 12, 14 tavsiye edilmez. BMD yöntemi dalbavansin yatkınlığın gelecekteki değerlendirilmesi için kullanılmalıdır ve ticari antimikrobiyal duyarlılık testlerinin geliştirilmesi için altın standart olarak.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.

Materials

Dalbavancin Metrics, Inc. Greenville, NC BI-397
Vancomycin Sigma-Aldrich St. Louis, MO C5793
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth Becton Dickinson Sparks, MD 212322
Lysed horse blood Cleveland Scientific Bath, OH
Dose-it peristaltic pump Integra Biosciences Hudson, NH
Multi-channel pipet (Viaflo II) Integra Hudson, NH 4164
12 channel pipet (Matrix) ThermoFisher Scientific Waltham, MA
Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) VistaLab Brewster, NY
96 well microplate Greiner Bio-one Monroe, NC 650161
50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
16x125mm disposable glass tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
12x17mm snap cap, polystyrene tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
16 mL centrifuge tubes BioExpress Kaysville, UT C-3394-2
Reagent reservoirs Integra Biosciences Hudson, NH 4312
Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) Biologix Lenexa, KA 65-0001,65-0010
Tryptic soy agar + 5% sheep blood Becton Dickinson Sparks, MD
Incubator (ambient) Sanyo
Incubator (5% CO2) Sanyo
Analytical balance  ThermoFisher Scientific Waltham, MA
Gloves Kimberly-Clark 52817
Lab coats
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boucher, H. W., et al. Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection. The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).
  2. . . M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , (2015).
  3. . . M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , (2015).
  4. . Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems — Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices — Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases. ISO/FDIS. 20776-1, (2006).
  5. Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin. Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).
  6. Turnidge, J., Paterson, D. L. Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints. Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).
  7. Rennie, R. P., et al. Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent. Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).
  8. Arhin, F. F., et al. Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing. Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).
  9. Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies. Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).
  10. Ribbon Panel, B. l. u. e. Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories. MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).
  11. Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity. Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).
  12. Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132. ASM. , (2012).
  13. Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms. Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).
  14. Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).
  15. Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012). Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).

Tags

Antimicrobial Susceptibility TestingDalbavancinBroth MicrodilutionCLSIISODMSOPolysorbate 80Staphylococcus AureusMRSAStreptococcusEnterococci

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Koeth, L. M., DiFranco-Fisher, J. M., McCurdy, S. A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. J. Vis. Exp. (103), e53028, doi:10.3791/53028 (2015).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image