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Immunologie et infection

Un riferimento brodo di microdiluizione per Dalbavancina<em> In Vitro</em> Test della Sensibilità di batteri che crescono aerobico

Published: September 09, 2015
doi:
10.3791/53028
, ,
1Laboratory Specialists, Inc, 2Clinical Microbiology, Actavis plc

Summary

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Abstract

Test di sensibilità antimicrobica (AST) viene effettuata per valutare l'attività in vitro di agenti antimicrobici contro vari batteri. I risultati AST, che sono espressi come in concentrazioni minime inibenti (MIC) sono utilizzati nella ricerca per lo sviluppo antimicrobica e monitorare lo sviluppo di resistenza e in ambito clinico per l'orientamento terapia antimicrobica. Dalbavancina è un lipoglycopeptide semi-sintetico agente antimicrobico che è stato approvato maggio 2014 dalla Food and Drug Administration (FDA) per il trattamento delle infezioni della pelle e pelle struttura batteriche acute causate da Gram-positivi. Il vantaggio di dalbavancina rispetto agli attuali terapie anti-stafilococco è la sua lunga emivita, che permette il dosaggio una volta alla settimana. Dalbavancina ha attività contro Staphylococcus aureus (inclusi sia S. aureus [MSSA] e meticillino-resistente Staphylococcus aureus [MRSA] sensibile alla meticillina), stafilococchi coagulasi-negativi, <em> Streptococcus pneumoniae, Streptococcus gruppo anginosus, β-emolitici streptococchi e vancomicina enterococchi sensibili. Simile ad altri agenti lipoglycopeptide recenti, l'ottimizzazione di CLSI e ISO brodo metodi di test di sensibilità comprende l'uso di dimetilsolfossido (DMSO) come solvente nella preparazione soluzione madre e polisorbato 80 (P80) per alleviare l'adesione dell'agente di plastica. Prima degli studi clinici e durante lo sviluppo iniziale di dalbavancina, studi di sensibilità non sono stati effettuati con l'uso di P-80 e MIC risultati tendevano ad essere 2-4 volte maggiore e similmente superiore MIC risultati sono stati ottenuti con il metodo della diluizione suscettibilità agar. Dalbavancina era prima incluso nell'aggiornamento microdiluizione in brodo CLSI tabelle metodologia nel 2005 e modificato nel 2006 per chiarire l'uso di DMSO e P-80. La procedura di microdiluizione brodo (BMD) mostrato qui è specifico per dalbavancina ed è in conformità con i metodi CLSI e ISO, con particolare step-by-step e focnoi sui passaggi critici aggiunto per chiarezza.

Introduction

Dalbavancina è un lipoglycopeptide semi-sintetico che è stato approvato dalla FDA nel maggio 2014 per il trattamento delle infezioni della pelle e pelle struttura batteriche acute causate da Gram-positivi 1. L'obiettivo primario di dettagliare questo metodo in un formato video è quello di fornire indicazioni chiare agli laboratorio e di ricerca gli scienziati clinici per i test e la comunicazione dei risultati dalbavancina suscettibilità accurati e riproducibili.

La determinazione di un agente antimicrobico MIC con metodi commerciali è eseguita di routine in laboratori clinici per la valutazione dell'attività di un agente in vitro contro i batteri patogeni. Il metodo qui descritto è il metodo di microdiluizione brodo, come raccomandato dal CLSI e ISO 2,3,4. Dal momento che la dalbavancina metodi suscettibilità commerciali non sono attualmente disponibili (al momento della pubblicazione) e la diffusione del disco e dei metodi di diluizione in agar non sono attualmente Fo dalbavancina, metodi di diluizione riferimento brodo sono le opzioni attualmente disponibili 12,14. Dato che questo metodo di riferimento non è un commerciale e approvato dalla FDA metodo diagnostico in vitro, laboratori clinici negli Stati Uniti che utilizzano questa procedura per il test del paziente devono rispettare i requisiti normativi per un test sviluppato in laboratorio (LDT). Si prevede che come l'uso dalbavancina aumenta, più laboratori avranno necessità di testare questo composto. Test Vancomicina come surrogato per la determinazione di dalbavancina sensibilità di S. aureus è stato convalidato 5. Tuttavia, la dalbavancina può essere attiva contro vancomicina intermedio S. aureus (VISA) e, quindi, i medici possono richiedere i risultati dalbavancina MIC. Inoltre, i risultati MIC per altre specie batteriche possono essere richiesti.

Il punto di interruzione suscettibile FDA per la dalbavancina contro S. aureus è stato istituito a ≤0.12 mg / ml. FDA assegnato solo suscettibilitàcategoria bile a causa della mancanza di dati sulla isolati resistenti. La distribuzione normale MIC tra wild type S. aureus isolati è tra 0,03-,12 mcg / ml, con una chiara MIC modale di 0,06 mg / ml. Una leggera variazione nei risultati MIC causa della differenza di metodo, oltre alla variazione intrinseca BMD di ± una diluizione, potrebbe potenzialmente avere un impatto significativo sui tassi di suscettibilità. 6 Simile ad altri agenti lipoglycopeptide, test di sensibilità la dalbavancina può essere difficile a causa solubilità e le dimensioni relativamente grandi della molecola e le sue proprietà di legame 7,8,9. Il metodo BMD riferimento qui descritto comprende due passaggi specifici che sono unici per agenti insolubili e / o agenti lipoglycopeptide: (1) l'uso di DMSO per la preparazione delle soluzioni madre e (2) aggiunta di 0,002% P-80 nel pannello MIC finale diluizioni. L'obiettivo di questa pubblicazione è quello di fornire il video chiarezza al metodo BMD dalbavancina e per SPECIFICHElly concentrarsi su questi passaggi chiave, per garantire risultati accurati e riproducibili MIC.

Protocol

Nota: fare riferimento ai documenti CLSI M7-A10 e M100-S25 e / o ISO / FDIS 20776-1 per tutti i dettagli del metodo di riferimento microdiluizione in brodo di sensibilità agli antibiotici 2, 3, 4 I metodi di riferimento consentono di opzioni in alcuni dei. specifiche procedure per la preparazione inoculo e pannello MIC di produzione per ottenere lo stesso risultato finale. Il metodo qui descritto si riferisce ad un agente antimicrobico, dalbavancina, e alcuni dei passi rappresentano uno dei diversi modi potenzialmente il metodo di riferimento può essere fatto. Le opportune precauzioni di sicurezza (in coerenza con livello di biosicurezza 2) dovrebbero essere utilizzati 10. Il pannello formato MIC utilizzato ai fini di questa pubblicazione viene proiettato in Tabella 1. 1. Conservare Dalbavancina Polvere Al ricevimento di diagnostica grado dalbavancina in polvere, conservare a -20 ° C in un ambiente essiccato in un congelatore non sbrinamento. Prima dell'uso, la polvere deve equilibrare araggiungere RT prima dell'apertura. 2. Preparare MIC del pannello diluizioni Preparare una soluzione madre non superiore a 1.600 mg / ml di dalbavancina in ordinata (puro) DMSO in tubi di vetro o di plastica sterili, e utilizzare lo stesso giorno di preparazione o conservare a -20 a -60 ° C o al di sotto per un uso futuro in un congelatore non sbrinamento. Prendere in considerazione la potenza di dalbavancina quanto previsto sulla documentazione ricevuta con la polvere, quando si pesa la polvere (vedi equazione 1 per esempio 800 mg / ml di brodo di preparazione). Diluire la diluizione azione simile allo schema come mostrato nella colonna 1 ("Sorgente concentrazione") nella tabella 2 con DMSO pulito in tubi di vetro o di plastica sterili. Utilizzare una pipetta per la misurazione di diluente e un altro pipetta per aggiungere la dalbavancina azione iniziale per il primo tubo. Per ogni successiva concentrazione dalbavancina magazzino usare una nuova pipetta. Preparare 100X finale concent pannello MICdiluizioni razione (concentrazioni intermedie) con DMSO pulito. Come mostrato nelle colonne 2-4 della tabella 2, unire volumi appropriati di sorgente e DMSO per ottenere concentrazione intermedia desiderato (volumi da utilizzare dipenderà dal numero di pannelli MIC da effettuare). Preparare 0.004% P80: Preparare una soluzione fresca di lavoro stock del 2% P80 con l'aggiunta di 0,1 ml a 4,9 ml P80 dH 2 O. Sterilizzare passando attraverso un filtro e uso soluzione 0,22 micron nello stesso giorno di preparazione. Preparare 0,004% P80 diluente facendo una diluizione 1: 500 del 2% P80 (ad esempio, 0,3 ml di 2% P80 a 149,7 ml di CAMHB). Ulteriori diluire le concentrazioni intermedie preparata al punto 2.2 1: 100 in catione regolato Mueller Hinton Broth (CAMHB) supplementato con 0,004% (v / v) polisorbato-80 (-80 P) P-80 e / o LHB (per streptococchi) aggiunto a doppia concentrazione finale per aggiunta di inoculo (passo 4.3) si tradurrà in una diluizione 1: 2. Vedere colonne 6 e 7 nella tabella 2 </strong>. 3. Preparare Pannelli MIC Dispensare 50 ml di ciascuna soluzione dalbavancina preparata al punto 2.3 in appositi pozzi del pannello MIC e includere i supporti in un solo bene (controllo della crescita bene). Una pipetta multicanale con punte sterili può essere utilizzata in questa fase. Utilizzare i pannelli immediatamente o sigillare con film plastico, posto in sacchetti di plastica e mettere subito in un congelatore non sbrinamento a ≤-20 ° C (preferibilmente a ≤-60 ° C) fino al momento dell'uso. Se si utilizzano i pannelli congelati, rimuovere sigilli e posizionare i pannelli individuali sul banco di laboratorio per 15-30 minuti (fino al contenuto dei pozzetti siano scongelati) prima di procedere alla inoculazione pannello. 4. Inoculare Pannelli MIC, eseguire la purezza e l'installazione Colony Conte Selezionare alcune colonie ben isolate da un 18-24 ore agar sangue o altra piastra agar non selettivo. Toccare la parte superiore di ogni colonia con un'ansa sterile o tampone e trasferimento a 1-5 ml CAMHB o sAline fino torbidità è equivalente a uno standard McFarland 0,5. Valutare torbidità per confronto visivo al 0,5 McFarland o con un dispositivo fotometrico. Entro 15-30 minuti dalla preparazione, diluire l'inoculo 1: 100 in CAMHB (100 ml in 10 ml CAMHB). Per la maggior parte dei batteri testati contro dalbavancina, ad eccezione di S. pneumoniae, questa diluizione fornirà una concentrazione finale di ben 5 x 10 5 CFU / ml (intervallo accettabile è 2-8 x 10 5 CFU / ml). Per S. pneumoniae, concentrazione batterica basata sul confronto di torbidità a 0,5 McFarland è tipicamente molto meno, quindi, diluire l'inoculo 1:25 (400 ml in 10 ml CAMHB + 10% + LHB). Entro 15 minuti dopo la preparazione dell'inoculo, trasferire 50 ml di inoculo finale in ciascun pozzetto (ad eccezione del controllo di sterilità e) del pannello MIC preparato al punto 3. pipetta multicanale con punte sterili può essere utilizzata in questa fase. Eseguire un controllo di purezzatrasferendo e diffondendo un'aliquota 1-10 microlitri dal controllo della crescita positivo anche utilizzando un'ansa sterile per un agar non selettivo (per esempio, TSA con il 5% di sangue di montone). Configurazione conteggio delle colonie prelevando 10 microlitri dal controllo della crescita e con un singolo canale pipetta e punta sterile e trasferimento a 10 ml di soluzione salina (1: 1.000 diluizione). Mescolare e trasferire 100 ul con un singolo canale pipetta e punta sterile per un mezzo adatto non selettivo agar (ad esempio, TSA con il 5% di sangue di montone) e si sviluppa su tutta la superficie agar con un'ansa sterile, ripetendo due volte in diverse direzioni per assicurare una distribuzione uniforme del inoculo (diluizione 1:10). 5. Pannelli Incubare MIC, Colonia di Conte e piastre Purezza Sigillare ogni pannello MIC o una pila di non più di 4 pannelli in un sacchetto di plastica, con nastro di plastica o con un coperchio di plastica aderente prima incubazione. In alternativa, inserire pannello MIC vuoto sul top di pila di non più di 4 pannelli MIC, mettere un tovagliolo di carta umida in un contenitore di plastica, pannelli luogo MIC nel contenitore di plastica e nei pressi del contenitore in modo sicuro con coperchio. Incubare pannelli MIC in un incubatore ambiente a 35 ° C ± 2 ° C per 16-20 ore (stafilococchi ed enterococchi) e 20-24 ore (streptococchi) entro 30 min di inoculazione. Incubare il conteggio delle colonie e le piastre di purezza nelle stesse condizioni, tranne streptococchi incubare in un incubatore CO 2 al 5%. 6. Leggere il MIC e Colonia Conte Piatti; Controllare Purezza Piastra Leggere il MIC come concentrazione minima che inibisce completamente la crescita batterica nei pozzetti rilevate tramite occhio nudo. Contare le colonie sulla piastra conta delle colonie. Moltiplicare ogni colonia fattore di diluizione (1: 10.000) (ad esempio, 50 colonie è equivalente a 5 x 10 5 CFU / ml). Un intervallo accettabile è 20-80 colonie (2-8 x 10 5 CFU / ml) e viene utilizzato come approguida ximate. Controllare piatto purezza. Se tutte le colonie sono simili alle colonie utilizzati nel passaggio 4.1, quindi l'inoculo può essere considerato puro. Se ci sono altre colonie presenti, allora esiste la possibilità di un contaminante di essere presente nel pannello MIC e il test deve essere ripetuto. 7. controllo di qualità Risultati. Fare riferimento alla Tabella 3 per i range attesi di ceppi di controllo qualità CLSI. Riportare i risultati di prova solo se isolati di risultati MIC dalbavancina per organismo di controllo della qualità (s) sono all'interno del range atteso. Se si ottiene una MIC di ≥0.25 ug / ml per ogni S. clinica aureus isolare, ripetere il test dalbavancina MIC e / o inviare ad un laboratorio di riferimento per la verifica.

Representative Results

Metodi MIC standardizzati sono necessari al fine di monitorare lo sviluppo di resistenza, un obiettivo importante di vari programmi di sorveglianza antimicrobici. Risultati Dalbavancina MIC per isolati raccolti in Europa e Stati Uniti nel 2011-2013 erano <0,25 mg / ml per il 99,9% di S. aureus e il 100% di streptococchi (tabella 4). Per valutare l'importanza di utilizzare fresca (sigillato) DMSO, test triplicato di MIC dalbavancina BMD per QC ceppi di S. aureus ATCC 29213, ed E. faecalis ATCC 29212 e duplicare test per S. pneumoniae ATCC 49619 è stata effettuata utilizzando (1) DMSO da fiale sigillate, (2) DMSO da una bottiglia 1 L che era entro la data di scadenza ed era stato precedentemente utilizzato per 2 anni e (3) una aliquota di DMSO dallo stesso 1 L bottiglia (campione 2) che è stato permesso di sedere in una coppa aperta per 72 ore prima dell'uso. Dalbavancina risultati MIC con pannelli realizzati con tutti e tre i campioni DMSO erano simili e well'ambito gamme QC accettabili (Tabella 5). La perdita di attività dalbavancina dopo esposizione della soluzione di riserva di plastica e senza l'aggiunta di P-80 è stata ben documentata 7. In 2 ulteriori studi, l'aggiunta di P-80 per le soluzioni madre iniziali e intermedie (Tabella 6) e l'uso di tubi di vetro o di plastica per la preparazione delle soluzioni madre iniziali e intermedie (Tabella 7) non ha avuto effetto sulla i risultati dalbavancina MIC. C'era anche alcun effetto sui risultati MIC dalbavancina quando polipropilene e polistirene piatti provenienti da tre produttori sono stati utilizzati (tabella 7). La presenza di sangue di cavallo lisato nei brodi di collaudo di streptococchi ha dimostrato di avere un'attività tensioattivo simile, paragonabile a P-80 7, 8. Il metodo di riferimento dalbavancina per streptococco include sia P-80 e lisato cavallo sangue ,tuttavia, a differenza di stafilococchi ed enterococchi, risultati dalbavancina MIC per streptococchi sono simili (entro +/- 1 diluizione) con e senza l'aggiunta di P-80. Come è stato precedentemente presentato e illustrato in figura 1, la diluizione dalbavancina agar (AD) microfoni sono tipicamente 2-8 volte superiore rispetto al riferimento di corrente BMD 12, 13, 14. Diversamente BMD, l'aggiunta di 0,002% P-80 non fa influenzare la dalbavancina AD MIC risultati 12. Equazione 1: Esempio di Dalbavancina soluzione madre Preparazione fasi di preparazione per 25 ml di 800 mg / ml soluzione dalbavancina.. Figura 1. Confronto tra Dalbavancina e Vancomicina BMD a AD. I risultati dello studio che ha confrontato dalbavaNCIN e vancomicina BMD e AD MIC risultati per selezionare isolati batterici Gram-positivi. Media (A) Dalbavancina e (B) Vancomicina microdiluizione in brodo e agar diluizione MIC risultati in mg / ml per 15 Staphylococcus aureus, 8 coagulasi negativi stafilococchi (CNS), 5 Enterococcus faecalis e 14 Streptococchi (Gruppi A, B, e C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 La DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0.03 DAL; 0.06 DAL 0,12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. B DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0.03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. C DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0.03 DAL 0,06 DAL0.12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. D DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0.03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. E DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0.03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0.25 </td> DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. F DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0.03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. Sol DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0.03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. H DAL 0,002 DAL 0,004 DAL 0,008 DAL 0,015 Dal 0.03 DAL 0,06 DAL 0,12 DAL 0.25 DAL 0.5 DAL 1 DAL 2 Pos Ctrl. DAL Dalbavancina <td> Le concentrazioni sono espressi in mg / ml dopo 50 microlitri / pozzetto inoculazione Tabella 1. MIC Piatto Formato. La mostra posizione 96 formato pozzetti di diluizioni Dalbavancina e pozzetti di controllo positivi utilizzato come esempio in questa pubblicazione il video 1 2 3 4 5 6 7 8 Fonte Conc. (mg / ml) Volume Fonte (ml) Volume DMSO (ml) Intermedio Conc. in DMSO (mg / ml) Volume Intermedio Conc. (ml) Volume CAMHB + 0,004% P80 * (ml) 2X Conc. Dopo diluizione 1: 100 in CAMHB (mg / ml) Finale Pannello Conc. Messaggio inoculazione (mg / ml) 800 1.0 1.0 400 0.02 1.98 4 2 400 0.5 0.5 200 0.02 1.98 2 1 400 0.5 1.5 100 0.02 1.98 1 0.5 400 0.5 3.5 50 0.02 1.98 0.5 0.25 50 0.5 0.5 25 0.02 1.98 0.25 0,125 50 0.5 1.5 12.5 0.02 1.98 0,125 0.06 50 0.5 3.5 6.25 0.02 1.98 0.06 0.03 6.25 0.5 </td> 0.5 3.13 0.02 1.98 0.03 0,015 6.25 0.5 1.5 1.5 0.02 1.98 0,015 0,008 6.25 0.5 3.5 0.8 0.02 1.98 0,008 0,004 0.8 0.5 0.5 0.4 0.02 1.98 0,004 0,002 Questa tabella è stata modificata da CLSI M100-S25, Tabella 8B 3 Tabella 2. Schema per la preparazione in diluizione agenti antimicrobici insolubili in acqua da Usato in brodo diluizione test di suscettibilità. I volumi di soluzioni di lavoro dalbavancina e diluenti per la preparazione di MIC finalesoluzioni Dalbavancina di ,002-2 mg / ml. Controllo Qualità Strain Previsto Dalbavancina MIC (mg / ml) S. aureus ATCC 29213 0,03-0,12 E. faecalis ATCC 29212 0,03-0,12 S. pneumoniae ATCC 49619 0,008-0,03 Tabella 3. Previsto Dalbavancina MIC Risultati per ceppi di controllo di qualità di 3, 11 risultati dei controlli qualità. CLSI per ceppi suggerite per essere testati con isolati clinici al fine di verificare la corretta metodologia Tabella 4. Distribuzione delle Dalbavancina Risultati MIC (numero ad ogni MIC) da USA ed europea 2011-2013 SurveillANCE Studio 15. Dalbavancina MIC risultati di uno studio pubblicato di recenti isolati clinici come indicatore della dalbavancina corrente attività in vitro. Isolare # Dalbavancina MIC (mg / ml) DMSO 1 DMSO 2 DMSO 3 S. aureus ATCC 29213 0.12 0.06 0.06 0.12 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 E. faecalis ATCC 29212 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 0.06 <em> S. pneumoniae ATCC 49619 0,015 0,015 0,015 0.03 0,015 0,015 DMSO 1 = fiamma non aperto sigillato 10 ml fiale DMSO 2 = bottiglia 1L aperto frequenti DMSO 3 = bottiglia 1L aperto frequenti – seduto su una panchina nel bicchiere scoperto per 72 ore Tabella 5. Dalbavancina MIC Risultati (mg / ml) con DMSO Archivio e intermedio diluizioni preparazione con DMSO da 3 fonti. I risultati di uno studio che ha confrontato MIC dalbavancina effetto dell'utilizzo di diversi solventi DMSO in preparazione dello stock dalbavancina e diluizioni intermedie. Isolare Numero Replicare Numero Dalbavancina MIC (mg / ml) DALB w / P80 in DMSO DALB w / o P80 in DMSO S. aureus ATCC 29213 1 0.06 0.06 2 0.06 0.06 3 0.06 0.06 4 0.06 0.06 S. aureus DP80-002SA clinica 1 0.03 0.03 S. aureus ATCC 700.699 1 0.5 0.5 S. pneumoniae ATCC 49619 1 0.03 0,015 2 0.03 0,015 3 0.03 0,015 4 0.03 0,015 S. pyogenes clinici: DP80-004PY 1 0,015 0,015 DP80-005PY 1 0.03 0.03 DP80-006PY 1 0.03 0,015 DP80-007PY 1 0.06 0.03 DP80-008PY 1 0.03 0,015 S. agalactiae clinica: DP80-009AG 1 0.06 0.12 DP80-010AG 1 0.06 0.03 DP80-011AG 1 0.06 0.06 DP80-012AG 1 0.06 0.06 S. dysgalactiae clinical DP80-013DY 1 0.03 0.03 S. pneumoniae clinica: DP80-014SP 1 0.06 0.06 DP80-015SP 1 0.03 0.03 DP80-016SP 1 0.03 0.03 DP80-017SP 1 0.06 0.06 Tabella 6. Dalbavancina MIC risultati utilizzando DMSO Archivio e intermedio diluizioni preparazione con e senza 0.002% P-80. I risultati di uno studio che ha confrontato MIC dalbavancina effetto di aggiungere 0.002% P-80 a dalbavancina magazzino e diluizioni intermedie. Isolare Replicare Numero </td> Diluizione della Tubi Micropiastra (Tipo di plastica) Poly-propilene, Greiner Polistirolo Bicchiere Plastico 1 ora di plastica 1h Plastica / Intermedio 1 ora Greiner Corning Nunc S. aureus ATCC 29213 1 0.06 0.03 0.03 0.03 0.06 0.03 0.06 0.03 2 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.06 3 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 E. faecalis ATCC 29212 <td> 1 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03 2 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03 3 0.06 0.06 0.06 0.06 0.03 0.03 0.06 0.03 S. pneumoniae ATCC 49619 1 0,015 0,015 0,015 0,015 0,008 0,008 0,008 0,008 2 0,015 0,015 0,015 0,015 0,008 0,015 0,008 0,008 Vetro = azione iniziale fatta in bottiglia di vetro, utilizzato immediatamente per rendere concentrazione intermedias in tubi di plastica, utilizzati immediatamente per fare diluizioni brodo. Plastica = stock iniziale fatto in provetta da centrifuga di plastica, usato immediatamente per rendere concentrazioni intermedie in tubi di plastica, utilizzate immediatamente per effettuare diluizioni brodo. 1 hr plastica = azione iniziale fatto in provetta da centrifuga di plastica, per non sedersi sulla panchina per 1 ora poi usato per fare concentrazioni intermedie in tubi di plastica, utilizzati immediatamente per fare le concentrazioni in brodo. Plastica 1 ora / Intermedio 1 hr = azione iniziale fatto in provetta da centrifuga di plastica, per non sedersi sulla panchina per 1 ora poi usato per fare concentrazioni intermedie in tubi di plastica, per non sedersi sulla panchina per 1 ora poi usato per fare le concentrazioni in brodo. Tabella 7. Dalbavancina MIC risultati utilizzando diluizioni della preparazione in plastica e vetro Tubi e tipi di lastre in plastica MIC. Risultati ofa la dalbavancina studio MIC che ha confrontato effetto dell'utilizzo tubi di plastica o di vetro durante la preparazione le soluzioni madre e anche effetto di utilizzare diverse fonti e tipi di plastica per micropiastre.

Discussion

I seguenti dettagli di metodo sono presentati per ulteriori considerazioni durante la preparazione per i test dalbavancina MIC. Il disegno del pannello MIC dipenderà dal numero di agenti antimicrobici da testare (es., Da solo o più agenti dalbavancina) e le specie di batteri da testare. Le concentrazioni Dalbavancina dovrebbero comprendere i punti di interruzione interpretative per tutte le specie batteriche da testare e l'intera gamma di diluizioni previste per almeno un ceppo di controllo di qualità. La serie di diluizioni antimicrobico può essere organizzata in righe o colonne a seconda del numero di agenti antimicrobici e / o isolati / piastra e metodo di inoculazione. Il volume di dalbavancina in polvere e il brodo deve essere calcolata per assicurare che quantità ottimali vengono prodotti e rifiuti è minima. Per l'esempio utilizzato in questa pubblicazione, volumi si basano sui preparazione di due pannelli MIC. Cation regolato Mueller Hinton brodo deve essere preparata e sterilizzato in autoclave secondo uomole istruzioni e la sterilità dei mezzi di comunicazione di produttori di realizza- verificati. MIC pannelli possono essere realizzati ed utilizzati sullo stesso giorno di preparazione oppure possono essere testati con microrganismi di controllo di qualità e pannelli convalidati conservati congelati per un uso futuro. È importante utilizzare tecniche sterili durante tutta la procedura.

Non ci sono criteri rigorosi per la verifica della concentrazione di inoculo con conta delle colonie. Conta delle colonie possono essere controllati inizialmente per ciascuna specie testate e / o periodicamente per convalidare il passo diluizione effettuata al punto 4.2. È importante che la validità dello standard 0,5 McFarland viene anche controllato regolarmente con E. coli ATCC 25922 utilizzando una procedura analoga al punto 4.5. Se i risultati non sono equivalenti a 1-2 x 10 8 UFC / ml, un nuovo standard McFarland 0,5 dovrebbe essere ottenuto. Se i conteggi delle colonie dai pozzi MIC sono al di fuori del range accettabile (2-8 x 10 5 CFU / ml consente e MIC per l'isolato clinica (s) variano da the atteso distribuzione normale (ad es. 0,03-0,12 ug / ml per S. aureus) e / o risultati MIC per isolare il controllo della qualità (s) sono al di fuori del range attesi, test di convalida è necessario e metodo di modifica può essere giustificata. Si suggerisce che una convalidato 0.5 standard di McFarland viene utilizzato per ripetere il conteggio delle colonie (s) e se i risultati sono ancora una volta al di fuori dei risultati attesi, la diluizione inoculo eseguito nella fase 4.2 deve essere regolato di conseguenza e il MIC ripetuto. Si noti che un controllo della purezza è necessaria anche se si esegue un conteggio delle colonie perché la procedura conteggio delle colonie utilizza un volume diluito che non necessariamente rilevare concentrazioni minori di organismi contaminanti.

Per un test MIC può essere considerata valida, la crescita accettabile deve avvenire nel controllo della crescita bene. Per la maggior parte dei batteri che saranno testati contro dalbavancina (es., Stafilococchi, streptococchi ed enterococchi, la crescita sarà visto come un pulsante (tipicamente> 2 mm) e meno frequently, la crescita può apparire come torbidità nel pozzo. A differenza di alcuni agenti antimicrobici che possono presentare effetti di trascinamento come aumentano le concentrazioni, gli endpoint dalbavancina sono in genere ben definiti. Ci sono vari dispositivi di visualizzazione allo scopo di favorire la lettura microdiluizione test, che possono essere utilizzati per leggere Dalbavancina piastre contenenti fino a quando non vi è alcun compromesso nella capacità di discernere crescita nei pozzetti.

Le fasi critiche all'interno del protocollo riguardano le parti del procedimento che sono legati alla solubilità di dalbavancina e l'aggiunta di P80. È importante che la concentrazione massima di dalbavancina utilizzato è non superiore a 1,600 g / ml, che DMSO viene utilizzato come solvente e che concentrazioni intermedie sono preparati in DMSO prima di effettuare le diluizioni brodo in modo che la concentrazione finale di DMSO in MIC Pannello pozzi non è maggiore di 1%. DMSO è igroscopico e quindi, l'uso di bottiglie precedenti di DMSO era un consideration per quanto riguarda la dalbavancina solubilità. Tuttavia, mentre un piccolo studio BMD con ceppi di controllo di qualità ha dimostrato che questo non essere una variabile importante (vedi la sezione risultati), è buona norma utilizzare bottiglie nuovi o di recente apertura di DMSO. E 'anche importante che P80 viene aggiunto al brodo nella fase finale di preparazione di diluizione del farmaco ed è ad una concentrazione finale di 0,002% in MIC bene.

La procedura BMD qui incluso utilizza preparazione di pannelli MIC utilizzando 50 microlitri / pozzetto a dalbavancina e P-80 concentrazioni due volte la concentrazione finale dell'inoculo con aggiunta di 50 microlitri / pozzetto in modo che il volume finale / pozzetto è di 100 microlitri. Questo metodo consente un formato del pannello MIC da produrre per la sperimentazione di entrambi S. aureus e S. pneumoniae perché il sangue lisato di cavallo può essere aggiunto al inoculo. Metodi alternativi per la preparazione di pannelli MIC utilizzando 100 microlitri / pozzetto con aggiunta di fino a 10 microlitri / pozzetto sono descritti nelProcedure CLSI e ISO.

Il punto di interruzione suscettibile dalbavancina per S. aureus è ≤0.12 mg / ml (FDA foglietto illustrativo). Come mostrato in recente sorveglianza, la maggior parte degli isolati sono inibiti dalla Dalbavancina a livelli di 0,06 mg / ml 15. Con un punto di interruzione suscettibile vicino alla MIC modale, qualsiasi variazione di MIC come risultato di differenze metodo può influenzare i tassi di suscettibilità. Poiché la procedura BMD per dalbavancina include alcuni passaggi unici (in particolare, l'uso di DMSO in preparazione del magazzino e diluizioni di droga intermedi e 0,002% P80 nel MIC bene, è imperativo che il metodo è seguito esattamente. L'organismo S. aureus QC (ATCC 29213) con un chiaro MIC dalbavancina modale di 0,06 mg / ml, è stato un buon indicatore di variazione metodo e deve essere usata come metodo per validare il metodo BMD. Se i risultati MIC sono con il range atteso di ,03-,12 mg / ml, ma sono trend sia al basso o high lato di questa gamma, un'ulteriore validazione del metodo è garantito.

L'aggiunta di 0,002% P80 è raccomandato per tutti gli organismi pertinenti Gram-positivi (staphylococcci, enterococchi e streptococchi.) Tuttavia, è da notare che è stato dimostrato che lisato sangue di cavallo agisce simile a P-80 rispetto al suo anti-binding capacità e che l'aggiunta di P-80 a CAMHB + LHB ha alcun effetto aggiuntivo sulla dalbavancina streptococchi risultati MIC.

Non vi è alcun metodo di diffusione del disco per il test dalbavancina e per la scarsa correlazione tra BMD e risultati AD, test di sensibilità della dalbavancina con il metodo AD non è raccomandato 12, 14. Il metodo BMD deve essere usato per la futura valutazione dalbavancina suscettibilità e come standard di riferimento per lo sviluppo di test di sensibilità antimicrobici commerciali.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.

Materials

Dalbavancin Metrics, Inc. Greenville, NC BI-397
Vancomycin Sigma-Aldrich St. Louis, MO C5793
Cation Adjusted Mueller Hinton Broth Becton Dickinson Sparks, MD 212322
Lysed horse blood Cleveland Scientific Bath, OH
Dose-it peristaltic pump Integra Biosciences Hudson, NH
Multi-channel pipet (Viaflo II) Integra Hudson, NH 4164
12 channel pipet (Matrix) ThermoFisher Scientific Waltham, MA
Single channelpPipets (Ovation 10 µL – 100 µL) VistaLab Brewster, NY
96 well microplate Greiner Bio-one Monroe, NC 650161
50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
16x125mm disposable glass tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
12x17mm snap cap, polystyrene tubes ThermoFisher Scientific Waltham, MA
16 mL centrifuge tubes BioExpress Kaysville, UT C-3394-2
Reagent reservoirs Integra Biosciences Hudson, NH 4312
Disposable sterilelLoops (1 uL & 10 uL) Biologix Lenexa, KA 65-0001,65-0010
Tryptic soy agar + 5% sheep blood Becton Dickinson Sparks, MD
Incubator (ambient) Sanyo
Incubator (5% CO2) Sanyo
Analytical balance  ThermoFisher Scientific Waltham, MA
Gloves Kimberly-Clark 52817
Lab coats
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References

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Citer Cet Article
Koeth, L. M., DiFranco-Fisher, J. M., McCurdy, S. A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. J. Vis. Exp. (103), e53028, doi:10.3791/53028 (2015).
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