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Bio-ingénierie

Modelo de polarizado Neural tisular basada Silk-colágeno-Engineered 3D

Published: October 23, 2015
doi:
10.3791/52970
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Tufts University, 2Department of Pediatrics,University of Connecticut Health Center & Connecticut Children’s Medical Center

Summary

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Abstract

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Introduction

El sistema nervioso central (CNS) puede ser afectada por una variedad de trastornos que implican vascular, estructural, funcional, infeccioso o degenerativo. Se estima que unos 6,8 millones de personas mueren cada año como consecuencia de los trastornos neurológicos, lo que representa una carga socioeconómica en crecimiento en todo el mundo 1. Sin embargo, sólo unos pocos de los trastornos tienen tratamientos disponibles. Por lo tanto, hay una necesidad crítica de estrategias terapéuticas innovadoras para pacientes que sufren de trastornos neurológicos. Desafortunadamente, muchas terapias orientados SNC fracasan durante los ensayos clínicos, en parte debido a la utilización de los modelos de investigación pre-clínicos inadecuados, que no permiten la evaluación de los efectos agudos y crónicos con lecturas funcionales fisiológicamente relevantes.

A pesar de los esfuerzos de investigación significativos en las últimas décadas, hay una gran cantidad desconocida acerca de la estructura y función del sistema nervioso central. Con el fin de obtener más conocimientos, modelos animales son frecuentemente nosed modelar estados patológicos, tales como lesión cerebral traumática (TBI) o demencia, sobre todo en los estudios preclínicos. Sin embargo, los animales difieren significativamente de los seres humanos, tanto en la anatomía del sistema nervioso central, así como en función, expresión génica y el metabolismo 2-4. Por otra parte, los cultivos 2D in vitro son el método común para investigar la biología celular y se utilizan de forma rutinaria para el descubrimiento de fármacos. Sin embargo, los cultivos celulares 2D carecen de la complejidad y la relevancia fisiológica en comparación con cerebro humano 5-7. Mientras que no hay sustituto para el bajo costo y la sencillez de los estudios de cultivo celular en 2D o la complejidad proporcionada por los modelos animales, la ingeniería de tejidos 3D podría generar mejores modelos de investigación para cerrar la brecha que existe entre el 2D in vitro e in vivo enfoques. La ingeniería de tejidos 3D proporciona condiciones experimentales más fisiológicamente relevantes obtenidos por las interacciones célula-célula en 3D y señales extracelulares proporcionadas por los biomateriales. Despite la evidencia significativa detrás del valor de las culturas en 3D, en la actualidad hay sólo unos pocos modelos de tejido 3D SNC como madre derivadas de células culturas organoides 8-10, neurospheroids 11 y se dispersaron culturas hidrogel 12,13. Métodos técnicos avanzados, incluyendo la litografía de múltiples capas 14, y la impresión 3D 15 se han utilizado para el estudio de los pulmones, el hígado y el tejido renal. Sin embargo, hay una falta de modelos 3D del SNC que permitan el crecimiento neuronal compartimentada, como imitando la arquitectura cortical y la biología. Separado el crecimiento de las neuritas de los cuerpos celulares neuronales se ha demostrado previamente en cultivos 2D mediante el uso de microfabricación 16,17 permitiendo el estudio de rastreo tracto axón, el influjo de calcio, arquitectura de red y actividades. Esta idea nos inspiró para desarrollar un tejido neural polarizado 3D donde se encuentran los cuerpos celulares y tractos axonales en diferentes compartimentos que imitan la arquitectura de capas del cerebro 18 </sup>. Nuestro enfoque se basa en el uso de diseño único andamio de seda que tiene capacidad de alta densidad de células en un volumen confinado y permite consecuencia de densa red axonal en un gel de colágeno. Aquí se demuestra el procedimiento de montaje completo del tejido cerebral como incluyendo la fabricación de andamios y la cultura neuronal.

Protocol

El protocolo de aislamiento de tejido cerebral fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Tufts y cumple con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión B2011-45). 1. Preparación de la Seda Andamios Preparación de la solución de seda de los capullos Bombyx mori como se describió previamente 19,20. Corte cada capullo en 8 partes iguales utilizando tijeras. Utilice unos 11 capullos de 5 g de capullos fragmentados. (15 minutos) Prepare 2 L de M Na 2 CO 3 solución de 0,02 y ponerla a hervir utilizando una placa caliente. (15 minutos) Pesar 5 g de capullos fragmentadas y hervirlas en Na 2 CO 3 solución durante 30 minutos. Revuelva la seda hirviendo cada par de minutos con una espátula. Este paso, también llamada de-engomado, purifica fibroína de seda de proteínas hidrófilas, sericins. (30 minutos) <li> Escurra la fibroína a mano y enjuague en agua destilada al menos tres veces para lavar cualquier sericina restante y productos químicos. (5 minutos) Coloque la fibroína húmedo en una placa de Petri y se seca el extracto fibroína en la campana de flujo O / N. Al día siguiente, pesa la masa fibroína seco y colocar la fibroína en un vaso de vidrio. (15 minutos) Con el fin de disolver la fibroína en solución 9,3 M LiBr, calcular el volumen requerido (en ml) de LiBr multiplicando la masa de fibroína seca por 4. Verter lentamente solución de LiBr sobre la fibroína de seda y sumergir todas las fibras de fibroína usando una espátula. Cubrir el vaso para evitar la evaporación y colocarlo a 60 ° C durante 4 horas para permitir que las fibras se disuelven. (15 minutos) El uso de la jeringa, recoja la solución fibroína del vaso de precipitados y cargarlo en los MWCO 3.500 casetes de diálisis. Realizar la diálisis frente a agua destilada durante 48 horas. Cambie el agua cada dos horas. El uso de la jeringa, recoger la solución de fibroínalos cassettes en 50 ml tubos cónicos y se centrifuga dos veces a 9.000 rpm (~ 12.700 xg) a 4 ° C durante 20 min. Verter el sobrenadante en un tubo nuevo después de cada etapa de centrifugación y desechar el sedimento. (40 min) Medir la concentración de la fibroína mediante la estimación del peso en seco. Vierta 1 ml de solución de seda en una barca pesar. Secar la muestra en el horno a 60 ° C durante 2 hr. Pesar la fibroína de seda seco y calcular la concentración de la solución de fibroína de seda multiplicando el peso obtenido por 100. La concentración esperada de solución de seda es 6-9% (w / v). Ajustar la concentración de seda a 6% (w / v) mediante la dilución en agua destilada. Punto de detención: La fibroína de seda líquida se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de un mes, en un recipiente cerrado. Preparación de andamios porosos de solución de seda. Tamizar la NaCl granular para separar los gránulos de tamaño de 500-600 micras, que se utilizará en pasos posteriores. Deseche el gránulos de tamaño por debajo de 500 micras y por encima de 600 micras. (15 minutos) Verter 30 ml de solución de seda 6% en el molde de politetrafluoroetileno (PTFE) (Figura 1). Esparcir suavemente 60 g de tamizado NaCl sobre la seda. Toque en el recipiente para obtener una capa uniforme de sal. Incubar 48 horas a RT para polimerizar el seda. Coloque el molde de PTFE que contiene andamio en el horno a 60 ° C durante 1 hora para finalizar la polimerización y se evapore todo el líquido restante. Coloque el contenido del molde de PTFE en un vaso de precipitados que contenía 2 L de agua destilada durante 48 horas para lixiviar la sal. Cambie el agua 2-3 veces al día. Retirar los andamios de esponja de los moldes cuando la sal está completamente lixiviado punto de detención:. Las esponjas se pueden almacenar sumergido en agua a 4 ° C en un recipiente cerrado para evitar que los andamios de la deshidratación. Cuando esté listo, cortar los andamios con 5 mm punzón de biopsia de diámetro. Precortadas los andamios para alcanzar unos 2 mm de altura. PuNCH ​​a cabo el centro del andamio con el punzón de biopsia 2 mm de diámetro (Figura 2A). (1 hr) Autoclave los andamios sumergidas en agua para esterilizarlos (ciclo de mojado, 121 ° C, 20 min) punto de detención:. Las esponjas se pueden almacenar sumergido en agua a 4 ° C en un recipiente cerrado para evitar que los andamios de la deshidratación. Antes de la siembra de células planeado, sumerja los andamios en solución estéril 0,1 mg / ml de poli-D-lisina (PDL). Incubar durante 1 hora a 37 ° C. Lavar los andamios 3 veces con tampón fosfato salino (PBS) para eliminar PDL no unido. (30 minutos) 2. Aislamiento de rata neuronas corticales Diseccionar cortezas del día embrionario 18 ratas (E18) Sprague-Dawley como se describe anteriormente por Pacifici y Peruzzi 27 después de obtener animales protocolo aprobado. (2 hr) Incubar 10 cortezas en 5 ml de tripsina al 0,25% con 0,3% de DNasa I (de páncreas bovino) durante 20 min a 37 ° C. Inactivar la tripsina mediante la adición de un volumen igual de / proteína de soja ml 1 mg. Se tritura las cortezas utilizando 10 ml de pipeta Pasteur por pipeteando arriba y abajo 20 veces hasta que se genera una suspensión de células individuales. Sea amable y evitar la formación de burbujas de aire. (10 minutos) Centrifugar la suspensión celular a 127 xg durante 5 min. Vuelva a suspender el sedimento celular en 10 ml de medio de cultivo (medio Neurobasal, suplemento de B27 1x, 1x Glutamax, 1% penicilina / estreptomicina). Contar las células. La concentración celular esperada es de aproximadamente 2×10 7 / ml. (20 min) 3. Construir Asamblea y Cultura Andamios siembra con las células. Mueva los andamios estériles y todos los utensilios necesarios dentro de una campana de cultivo celular. Usando pinzas estériles colocan los andamios en una placa de cultivo celular de 96 pocillos de asignar un andamio por pocillo. (10 minutos) Sumergir los andamios en medio de cultivo celular para equilibrar ellos antes de la cavidad de la semillaEn g. Incubar durante 1 hora a 37 ° C. (10 minutos) Aspirar el exceso de medio a partir de los andamios. Aplicar 100 l de suspensión de células / andamio. (10 minutos) Se incuban las células a 37 ° CO / N para permitir la unión de las células al andamio. A la mañana siguiente aspirar las células no inscritos y aplicar 200 l / pocillo de medio de cultivo fresco. (10 minutos) Andamio incrustación con matriz de colágeno. (2 hr) Coloque 10x PBS, agua, NaOH 1 N y cola de rata I colágeno en hielo. Preparar una solución de trabajo de colágeno de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mantener en hielo hasta las construcciones de células sembradas están listas (hasta 1 hora). Retire las construcciones de seda sembrado de células de la incubadora y aspirar el exceso de medio. Usando pinzas estériles transfieren los andamios a los pozos vacíos en la placa de bien y se sumergen cada andamio en 100 l de solución de colágeno 3 mg / ml. Coloque la placa de cultivo de tejidos de regresoen la incubadora durante 30 minutos para permitir la polimerización del colágeno. Aplicar 100 l de medio de cultivo celular pre-calentado / pocillo. Cultura los constructos durante una semana cambiando el medio cada día mediante la sustitución de sólo la mitad del volumen del medio. 4. Análisis de Microscopía Tinción vivo / muerto (1 hora) Preparar la solución madre de yoduro de propidio (PI) 1 mg / ml (1,5 mM) en agua destilada. Preparar solución madre de diacetato de fluoresceína (FDA) 2 mg / ml en acetona. Preparar la solución de trabajo que contiene 10 PI M y 0,15 M FDA diluido en PBS. Pre-calentar la solución a 37 ° C en un baño de agua. Se lavan las células con PBS precalentado para eliminar las esterasas de suero. Aspirar el PBS. Aplique la solución pre-calentado a trabajar en las células durante 2 minutos y lavar con PBS. Utilice microscopio de epifluorescencia a la imagen de las células (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, em λ = 514 nm). La mancha se mantiene estable durante 40 min. Tinción prolongada puede resultar en la tinción inespecífica que resulta de la captación de PI por las células y co-localización de PI / FDA en las células. Inmunoticción En el punto de tiempo deseado de la cultura fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA) durante 30 min a TA. Debido a la toxicidad de la PFA humos de la etapa de fijación se debe realizar en la campana de humos química. Lave los andamios con 3x PBS punto de detención:. Las construcciones fijas-PFA se pueden almacenar en PBS a 4 ° C durante varios días antes de proceder con nuevas medidas. Incubar los andamios en el 0,2% Tritón, 0,25% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS que contenía anticuerpo primario O / N a 4 ° C. El día siguiente descarta la solución de tinción y lavar los andamios 3 x 30 min con PBS para eliminar el anticuerpo primario no unido. Se incuban las muestras con el anticuerpo secundario diluido en 0,2% Triton, 0,25% de BSA en PBS durante 2hr a RT. Retirar la solución de tinción y lavar los andamios 3 x 30 min con PBS para eliminar el anticuerpo secundario no unido. Imagen de los andamios utilizando un microscopio confocal con objetivo 20X tomando 100 micras z secciones de la muestra con 1 m paso. Para visualizar las neuritas delgadas la resolución de la imagen debe ser de un mínimo de 1.024 x 1.024 píxeles. ARN, ADN y el aislamiento de proteínas Nota: RNA, DNA y el aislamiento de proteínas se realiza usando un kit comercial DNA Mini AllPrep / ARN / proteína de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Usando pinzas estériles transfieren los andamios de placa de cultivo a un tubo estéril de 2 ml. Coloque un andamio por tubo. Añadir 200 l de tampón RLT a cada tubo. Interrumpir el constructo fragmentando con micro tijeras estériles. Para homogeneizar el tejido interrumpido, transferir el contenido del tubo para la columna de centrifugación. Haga girar durante 2 minutos a toda velocidad en una microcentrífuga.El lisado se homogeneizó a medida que pasa a través de la columna de centrifugación. Recoger el flujo a través y utilizarla inmediatamente para aislar RNA, DNA y proteínas siguiendo el protocolo del fabricante. Cuantificar el rendimiento de los ácidos nucleicos cualquier otro método compatible (por ejemplo, NanoDrop). Cuantificar el rendimiento de proteína utilizando ensayo de proteína BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Medir el resultado de ensayo usando lector de microplacas a 562 nm de longitud de onda. Nota: El rendimiento esperado de los ácidos nucleicos y proteína por construcción en relación con la densidad celular se muestra en la Figura 4.

Representative Results

Solid esponjas de seda de precorte a la forma de rosquilla representa una idea única y simple para lograr una arquitectura compartimentada se asemeja tejido neural (Figura 2A). La estructura altamente porosa del andamio con el tamaño de poro de aproximadamente 500 micras en el área de resultados excepcionalmente alta superficie que permiten la siembra y el crecimiento de células de alta densidad dentro de un pequeño volumen (2×10 7 / ml) (Figura 2B). Además, la alta porosidad del andamio permite la difusión irrestricta de nutrientes y desechos resultantes de la viabilidad superior de los cultivos de células densas más de marcos de tiempo extendidos. Tras la siembra de las neuronas adjuntar rápida y uniformemente a la superficie de los poros de andamios. Después de la unión celular es completa y las células se equilibran en el sustrato de seda, el andamio esponja se llena con la matriz de colágeno suave con el fin de proporcionar un entorno 3D para la formación de la red axonal (Figura 3 </strong>). En ausencia de la matriz de colágeno de la compartimentación de los axones y cuerpos celulares no es posible, ya que las neuronas crecen extensiones sólo en la superficie de los poros que resultan en redes mixtas como se encuentra con las superficies 2D (Figura 3B). En contraste, el gel de colágeno proporciona una malla que soporta extensa crecimiento axonal en 3D, mientras que los cuerpos celulares neuronales permanecer unidos a la andamio de seda (Figura 3C). Este patrón de crecimiento conduce a la compartimentación de los cuerpos celulares y redes axonal puros (Figura 3D), que se asemeja a la materia gris y blanca de la corteza del cerebro. Aparte de microscopía, las construcciones se pueden evaluar con una variedad de otros métodos 18, dependiendo de la pregunta detrás del experimento. Por ejemplo, el aislamiento de ADN, ARN y proteínas de las construcciones se puede realizar fácilmente utilizando kits comerciales (Figura 4). El rendimiento de ácidos nucleicos y de proteínas PEr constructo depende del número de células sembradas inicialmente en los andamios de seda. Los más células sembradas mayor es el rendimiento de ADN, ARN y proteínas. Figura 1. molde de PTFE utilizado para la preparación de andamios esponja de seda Las dimensiones:.. 10 cm de diámetro, 2 cm de altura Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. 3D modelo de tejido cerebral similares. (A) poroso andamio esponja seda. (B) en vivo tinción / muertos de las neuronas en el día 1 en la siembra en andamio de seda antes de colágeno incrustar (células-verde vivo, células de color rojo-muertos). Los paneles en el lado derecho muestran la magnification del área capturada en cuadros rojos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. Neuronal consecuencia compartimentada en el modelo de tejido cerebral como 3D (A) compartimentos de andamios:. Compartimiento del cuerpo de las células rojas, compartimento azul-axonal. (B) el patrón de crecimiento neuronal en el día 1 tras la siembra antes de la incrustación de colágeno. (C). Consecuencia neuronal en el día 7 tras la siembra en el compartimiento del cuerpo celular. (D) consecuencia neuronal en el día 7 tras la siembra en el compartimiento axonal. Verde -. ΒIIITubulin Haga clic aquí para ver una versión más grande de estacifra. Figura 4. Rendimiento esperado de (A) ARN y ADN y proteínas (B) por construcción en relación con la cantidad de células sembradas por andamio (± DE, n = 5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .

Discussion

Here we described the guidelines to assemble a compartmentalized 3D brain-like tissue model. The model is characterized by dense polarized culture of neurons resulting in the development of two morphologically different compartments: one containing densely packed cell bodies, second containing pure axonal networks. Overall, the scaffold architecture and growth pattern mimic brain cortical tissue including the six laminar layers and white matter tracts21.

The donut-shaped silk protein-based tissue model allows for modifications and tuning of mechanical properties, versatile structural forms, hydrogel fillers and cellular components. Thus, this tissue model establishes a base platform for a wide range of studies. Silk is a favorable candidate for biomaterial platforms due to its biocompatibility, aqueous-based processing, and robust mechanical and degradation properties22. The silk matrix also serves as a stable anchor to reduce collagen gel contraction over time in culture. The properties such as silk concentration and porosity of the scaffold used in this model have been previously adjusted to achieve optimal cell growth and mechanical properties resulting in brain-like tissue elasticity18,23,24. We suggest to keep these parameters constant to ensure the successful outcome and reproducibility of the experiments.

The 3D neuronal network formation was achieved by combining two types of biomaterials with different mechanical properties: a stiff scaffold to provide neuronal anchoring and a softer gel matrix to permit axon penetration and connectivity in 3D. Selective material preferences of the silk scaffold and soft hydrogel provide the underlying principle for compartmentalizing the neurons from the axonal connections. Due to the inert nature of the silk scaffold, functionalization with poly-D-lysine is required for neuronal attachment. However, other cell adhesion promoting factors can be applied such as RGD25 or fibronectin26. To achieve the 3D network formation the silk scaffold needs to be filled with hydrogel in a timely manner as soon as neurons are attached to the scaffold. Likewise, the collagen matrix filler can be replaced by other hydrogels, thus allowing the study of the influence of 3D extracellular environments on axonal network formation to serve as a platform to evaluate novel hydrogels in terms of neuronal compatibility. Additionally, apart from rat cortical neurons other neuronal sources such as hippocampal neurons or induced pluripotent cell (iPSc)-derived neurons can be utilized. Moreover, the tissue model can be used to study heterocellular interactions by including glial cells along with neurons and to build more complex brain-like tissue.

As shown previously, our model can be utilized to evaluate neuronal functionality in 3D microenvironment with a variety of assays such as cell viability, gene expression, LC-MS/MS and electrophysiology, thus demonstrating physiological relevance of the model18. Other methods, which are frequently utilized to evaluate 3D tissue-engineered constructs, such as immunostaining and microscopy8,9,11 can also be used to assess cell distribution and extent of axonal network formation. However, it has to be noted, that due to the high density of the collagen matrix, the penetration of antibodies and depth of the imaging is limited to few hundred micrometers. Moreover, the signal to noise ratio may be affected by nonspecific background fluorescence. This can be overcome by using lipophilic cell tracers and genetically expressed fluorescent proteins which diminish the need for immunostaining11. Alternatively, the imaging can be performed with 2-photon microscopy instead of usual one-photon technique, which may reduce the signal loss, photobleaching, and can be extended to several hundred micrometers of depth.

Summarizing, the silk and collagen-based brain-like tissue offers a robust platform to study neuronal networks in 3D and is a starting point for the development of more advanced models of neurological disorders in the future. Independent from the mode of evaluation, the relative simplicity of this tissue model supports its utility, success and reproducibility.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the laboratory of Dr. Stephen Moss for providing embryonic rat brain tissues. M.D.T. designed the original protocol. This work was funded by National Institutes of Health P41 Tissue Engineering Resource Center Grant EB002520. K.C. was supported with Postdoctoral Fellowship from German Research Foundation (DFG) (CH 1400/2-1).

Materials

Na2CO3 Sigma-Aldrich 223530 –
LiBr Sigma-Aldrich 213225 –
MWCO 3500 dialysis cassettes  Thermo Fisher 66110 –
Heating plate Fisher Scientific Isotemp –
Centrifuge 5804 R Eppendorf – –
Sieve Fisher Scientific – No. 270, No. 35, No. 30
PTFE mold – – made in house (Figure 1) 10 cm diameter, 2 cm height
NaCl Sigma-Aldrich 71382 –
Biopsy Punch 5mm World Precision Instrument 501909 –
Biopsy Punch 2mm World Precision Instrument 501908 –
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-5MG final concentration 10 ug/ml, dissolved in water
PBS Sigma-Aldrich D1283-500ML –
Trypsin Sigma-Aldrich T4049-500ML –
DNase Roche 10104159001 final concentration 0.3%
Soybean protein Sigma-Aldrich T6522-100MG final concentration 1 mg/ml
Neurobasal medium Gibco 21103049 warm up to 37°C before use
B27 supplement 50x Gibco 17504-044 –
Glutamax Gibco 35050-061 –
Penicilin Streptomycin Corning 30-002-CI –
Collagen I, rat tail, 100 mg Corning 354236 final concentration 3 mg/ml
NaOH Sigma-Aldrich S2770 corrosive
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4170-10MG toxic
Fluorescein Diacetate Sigma-Aldrich F7378-5G –
Olympus MVX10 Olympus – –
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 toxic, final concentration 4%
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-10G –
anti-βIIITubulin antibody  Sigma-Aldrich T2200 rabbit 1:500
anti-rabbit Alexa-546 Molecular Probes A11010 goat 1:250
goat serum Sigma-Aldrich G9023-5ML –
Leica SP2 confocal microscope Leica – objective 20x
QIAshredder Qiagen 79654 –
AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit Qiagen 80004 –
Ethyl alcohol, Pure Sigma-Aldrich E7023  –
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich 63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific – –
BCA protein assay Thermo Scientific 23225 –
Plate reader Spectramax M2 Molecular Devices – absorbance 562 nm
Micro Scissors, Economy, Vannas-type TedPella 1346 –
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References

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Silk-collagenPolarized NeuronsBrain-derived NeuronsNeural NetworkAxonal GuidanceCell-cell InteractionCell-matrix InteractionElectrical Function

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Citer Cet Article
Chwalek, K., Sood, D., Cantley, W. L., White, J. D., Tang-Schomer, M., Kaplan, D. L. Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue. J. Vis. Exp. (104), e52970, doi:10.3791/52970 (2015).
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