Quantificazione dei citosolico vs. vacuolare<em> Salmonella</em> In primarie macrofagi di Permeabilization differenziale

Batteri patogeni intracellulari replicano direttamente nel citoplasma della cellula ospite, o in scomparti vacuolari specializzati ^1. Durante la fase iniziale dell'infezione maggior patogeni vengono internalizzati mediante fagocitosi da cellule specializzate (come macrofagi) o promuovendo attivamente il proprio assorbimento nelle cellule non fagocitiche. Nelle cellule fagocitiche, phagosome normalmente fonde con lisosomi per formare un vano degradativa, dove vengono digeriti particelle fagocitati. Batteri citosolici specializzati, come ad esempio Francisella novicida o Shigella flexneri, fuga degrado phagosomal inducendo la rottura del phagosome e successivamente fuga nel ^2,3 citoplasma. Ciò richiede meccanismo di virulenza associata come la Francisella patogenicità Island (FPI) o la Shigella flexneri T3SS, che inietta le proteine ​​effettrici che promuovono vacuolar rottura ^2-4. Le caratteristiche citosol della cellula ospiteun numero di recettori pattern recognition conservati che normalmente riconoscono la presenza di agenti patogeni e inducono immunitaria innata segnalazione ^5. Inoltre, xenophagy, una forma antimicrobica dell'autofagia può degradare batteri che entrano nel citosol. Batteri citosoliche sono normalmente ben adattati per smussare o aggirare queste risposte utilizzando diverse strategie. Ad esempio, Francisella modifica le sue LPS per non farsi riconoscere host e Shigella impedisce l'autofagia reclutamento utilizzando secrete proteine ​​effettrici ^6,7.

Un'altra strategia per sfuggire degradazione lisosomiale è impiegato dal modello vacuolare patogeno Salmonella enterica sierotipo Typhimurium, di seguito la Salmonella typhimurium. Salmonella utilizza un T3SS per iniettare effettori che rimodellano phagosome iniziale in sua nicchia intracellulare, la Salmonella -contenenti vacuolo (SCV) ^8,9. Manipolazione continua di percorsi di accoglienza ènecessaria per mantenere questo vacuolo attraverso l'assunzione di lipidi e altre sostanze nutritive per il vacuolo. In effetti, un mutante Sifa di Salmonella non riesce a mantenere la stabilità vacuolar, ed entra nel citoplasma delle cellule ospiti poche ore dopo l'infezione, che si traduce nell'attivazione di percorsi immunitario innato e l'autofagia reclutamento ^8. Fuga vacuolare di Salmonella varia a seconda del tipo di cellula che gli studi e numerose relazioni hanno dimostrato che nelle cellule epiteliali anche WT Salmonella può sfuggire la SCV e hyperreplicate nel citosol ^10. Recenti rapporti indicano che la diagnosi immunitario innato di patogeni vacuolari dipende anche dalla capacità di accoglienza di riconoscere e destabilizzare vacuoli da organismi patogeni che contiene (PCV) ^11-14.

Dato che sia l'host o batteri genotipo possono influenzare la distribuzione dei batteri intracellulari tra vacuolare e compartimento citosolico, è necessario quantificare il numero di vacuolare vs.batteri citosolici. Poiché, in configurazioni più sperimentali cellule ospiti sono infettate con più di un batterio, e successivamente può ospitare diversi batteri in differenti compartimenti subcellulari, è necessaria una tecnica che consente la quantificazione del livello di singoli batteri. Permeabilizzazione differenziale (noto anche come test di protezione phagosomal) fornisce la presente risoluzione ^2,4,10,12. Il saggio si basa sulla permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica della cellula ospite con la digitonina detersivo, che lascia membrane vacuolare intatta e consente così la colorazione selettiva di batteri citosolici con anticorpi. Qui forniamo due protocolli per la quantificazione dei citosolica e vacuolare Salmonella typhimurium con permeabilizzazione differenziale. Il principio di questo metodo è descritto nella Figura 1: di midollo osseo macrofagi derivati ​​(BMDMs) sono infettati con fase stazionaria mCherry esprimono Salmonella. Fase stazionaria Salmonella bisogno to essere utilizzato in quanto downregulate l'espressione della SPI-1 T3SS, la cui attività sarebbe altrimenti essere riconosciuto dal inflammasome NLRC4 e indurre la morte delle cellule rapido (pyroptosis) del BMDMs ^15. Dopo l'infezione le cellule sono lavate e trattati con 50 ug / ml di digitonina per 1 minuto. Le cellule vengono nuovamente lavati immediatamente e incubate con anticorpi anti-Salmonella accoppiati a FITC marcare batteri con accesso al citosol. Dopo un ulteriore lavaggio cellule passo vengono lisate e la percentuale di batteri mCherry + (vacuolare) e FITC + / + mCherry (citosolica) è determinata da FACS. Riportiamo anche un adattamento di questo metodo che può essere utilizzato se non ceppi proteine ​​esprimono fluorescenti sono disponibili (Figura 2). I passaggi aggiuntivi vengono introdotte dopo l'etichettatura FITC in cui le cellule sono fissi e completamente permeabilizzate. Successivamente tutti i batteri sono macchiati con anticorpi anti-Salmonella e anticorpi secondari corrispondenti. Detezione viene poi eseguita al microscopio invece di analisi FACS.