微珠植入斑马鱼胚胎

该程序与本协议描述的斑马鱼胚胎工作在Notre Dame大学被批准的机构动物护理和使用委员会。 1.林格氏液的制备使116 mM氯化钠，2.9 mM的氯化钾，3.6毫米氯化钙2和5毫摩尔的Hepes用超纯的H 2ö的溶液通过连续搅拌，以避免任何盐沉淀。 加入盐和溶液的同时仍然搅拌后，加入100单位/青霉素每毫升每毫升100微克链霉素。 加入所有抗生素和盐后，执行在无菌容器中的溶液和存储的过滤器灭菌。 注意：N-二苯基硫脲（1-苯基-2-硫脲）或PTU可加入林格氏液来阻止颜料在胎圈植入胚胎的形成没有负影响到胚胎健康。为了准备林格/色素沉着封闭液，使用concentration 0.003％机动部队。由于PTU的低浓度添加它是表示，林格氏液的较大体积进行，至少1升，以避免增加PTU粉末的微乎其微的量。在步骤1.2添加PTU，而解决方案是震撼人心。 2.三卡因溶液制备加入2克乙基3-氨基苯甲酸甲酸盐（三卡因）每升的溶液加0.1摩尔Tris，从1M的股票至pH 9.5平衡的和用超纯H 2 O制成注意：三卡因将用于安乐死的斑马鱼胚胎在期望的时间点，以测定珠子植入表型。 3. E3溶液的制备使0.25 M氯化钠，的10mM氯化钾，12.5毫米氯化钙2，和16.6毫硫酸镁至1升超纯水的溶液来创建1升的E3。 加入200μl亚甲基蓝的E3解决方案来抑制真菌生长。 为微珠转移4.牵引针用火抛光的硼硅玻璃长丝在一个外径：1.0mm时，编号：0.5毫米，在10厘米的长度。 将borosilicated玻璃成微量拉马准备细针。 注意：以下四个方面可作为一个起点，以拉动针：热= 540，拉= 245，速度= 200，和时间= 125。 后拉动针的足够数量的，存储在有盖的塑料陪替氏培养皿，放置在橡皮泥或胶带，以防止破坏针尖的条，直至使用。 修剪针尖到所需的缸径，用一双细镊子将比分针的结束。 注意：针孔大小将取决于所利用的微珠大小以及用户操控的喜好而变化。一个很好的出发点是工艺孔的尺寸在100至200微米的范围内，如果微珠从50-100微米会被利用。 PRIOR来使用，将修剪针插入毛细管持有人的方式完成转让微珠仪器。 5.晶须/睫毛工具准备获取晶须，睫毛，或其他小而坚定的一块天然或合成的头发丝。切断丝的根部附近，在一个45°角。坚持晶须使用永久性透明胶胶水P-1000枪头。 6.微珠植入托盘准备混合2克琼脂糖用100ml的E3溶液进行2％的E3琼脂糖凝胶。 加热1分钟和30秒的2％琼脂糖溶液在250毫升的Erlenmeyer烧瓶中，旋动烧瓶，每30秒，以避免从鼓泡过的凝胶。 取60毫米×15毫米的培养皿的盖子，将其放置在一个较大的150毫米×15毫米培养皿与内部朝上。 倒入热的琼脂糖凝胶为150毫米×15陪替氏培养皿，并确保固定下来的小培养皿用食指盖子。 注：允许一薄层的小培养皿盖子下面琼脂糖以除去缩合，将形成浇注的凝胶时;这将使珠更容易解剖显微镜下才能看到。 如琼脂糖冷却，但其固化​​之前，放置一个井模具上的凝胶。这将允许在胚胎更容易放置。 注意：为了避免在孔中的气泡，慢慢将模具成一角度，直到其浮在凝胶的顶部。 使用microspatula，小心地取出模具以及一旦凝胶凝固。加E3溶液，并储存于4℃。 7.胚胎收集准备交配室，由隔板隔开，通过填写他们与制水，然后把成年斑马鱼的男性（S）和女性（S）对在室O / N。 收集用细铁丝网过滤受精卵（胚胎阶段会略有不同）。 通过转动过滤器倒置并与E3的微细流漂洗它存入受精卵在一个干净的，直径10厘米的培养皿中，直到没有鸡蛋留在过滤器，并有大约25毫升的菜E3溶液。 采集后，将划分成鸡蛋几盘（每盘约50-60蛋），以避免过度拥挤，这可能会导致发育不同步离合器内，并收集所需的时间点很难。 孵育在E3溶液胚胎在28.5℃下根据标准斑马鱼分段系列40，使发展的评估。 注意：胚胎应转移到E3 / PTU在24小时受精后（HPF），以防止颜料的发展，如果操作在年龄较大的阶段必要的光学清晰度。 8.植入珠孵育在所希望的测试分子浓度的微珠或相应的车辆solution用于在适当的体积所需的时间。 注意：研究者可以使用的无菌培养皿中，从3-6厘米，直径，或多孔板，这两者使所述溶液中的微珠的可视化。时间可根据类型和感兴趣的分子的量变化，并且研究者应参考制造商或发表的建议为孵化和其它方面的持续时间，例如畏光和温度。 一旦胚胎已达到所希望的发育时间点，从使用细镊子其绒毛膜取出胚胎。 孵育在用抗生素进行10分钟的过滤林格氏溶液胚胎将它们适应到该溶液中。 而将胚驯化，转移微珠进微珠板注入托盘内坐落和冲洗他们在林格氏溶液10分钟。 注：达到该点之后植入物中50分钟的珠子。该W病减少，一个将植入与感兴趣的分子的较小浓度的珠子的可能性。 阵列胚胎成微珠注入托盘的孔中，注意到定向它们，以便感兴趣的区域，其中将植入的微珠可访问。 请使用钨针胚胎小切口。 转移微珠上使用微毛细管移液管胚胎：按压吸管的灯泡，轻轻拉动微珠到毛细管柱，然后释放到在期望的目的地传送所述微珠中的压力。 使用晶须/睫毛工具来定位胚胎内的微珠。注意：一定要微珠从切口部位插入定位组织这样走微珠不会从胚胎排出，因为它愈合。