qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Leslie A. Mitchell; Nick A. Phillips; Andrea Lafont; James A. Martin; Rupal Cutting; Jef D. Boeke

doi:10.3791/52941

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Biologie

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

Published: May 25, 2015

doi:

10.3791/52941

Leslie A. Mitchell¹, Nick A. Phillips¹, Andrea Lafont², James A. Martin¹, Rupal Cutting², Jef D. Boeke¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,Institute for Systems Genetics, ²Roche Life Science, USA

Summary

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Abstract

Il Progetto Genoma lievito sintetico (Sc2.0) mira a costruire 16 cromosomi del lievito di design e riunire in un'unica cellula di lievito. Ad oggi un cromosoma sintetico, synIII ^1, e un braccio cromosoma sintetico, synIXR ^2, sono stati costruiti e la loro funzione in vivo convalidato in assenza della corrispondente specie selvatiche cromosomi. Una caratteristica importante disegno di cromosomi Sc2.0 è l'introduzione di PCRTags, che sono brevi sequenze ri-codificato all'interno di lettura aperta (ORF) che consentono la differenziazione dei cromosomi sintetici dai loro omologhi di tipo selvatico. PCRTag primers ricottura selettivamente per entrambi i cromosomi di tipo sintetiche o selvatici e la presenza / assenza di ogni tipo di DNA può essere verificato utilizzando un semplice test PCR. La lettura standard del dosaggio PCRTag è valutare la presenza / assenza di ampliconi mediante elettroforesi su gel di agarosio. Tuttavia, con una densità media PCRTag amplicone di uno per 1.5 kb e agenome dimensione del ~ 12 Mb, il genoma Sc2.0 completato codificherà circa 8.000 PCRTags. Per migliorare il throughput, abbiamo sviluppato un saggio di rilevamento basato su PCR in tempo reale per PCRTag genotipizzazione che chiamiamo analisi qPCRTag. Il flusso di lavoro specifica di 500 reazioni nl in un piatto multipozzetto 1.536, che ci permette di testare fino a 768 PCRTags con entrambe le coppie di primer tipo sintetico e selvatici in un singolo esperimento.

Introduction

Sc2.0, o il Progetto Genoma lievito sintetico ( www.syntheticyeast.org ), ha fissato l'obiettivo di progettare e costruire un genoma eucariote completamente sintetico. Utilizzando la sequenza del genoma estremamente curata di Saccharomyces cerevisiae ³ come punto di partenza, ciascuno dei cromosomi lineari sedici è stato ri-progettato per soddisfare una serie di principi di progettazione che specificano mantenersi in forma delle cellule, migliorando la stabilità del genoma, e aumentando la flessibilità genetica. Ad esempio, gli elementi destabilizzanti come ripetizioni vengono cancellati dal cromosomi Sc2.0. Tutte le istanze di codoni di stop TAG sono ri-codificati per TAA a 'liberare' un codone nel ceppo finale per l'introduzione di un amminoacido non geneticamente codificato. Inoltre un sistema di evoluzione inducibile, Scramble, consentito dal sistema Cre-lox, permette la capacità senza precedenti di generare genomi derivati con nuove strutture ^4.

<p class="Jove_content"> Un altro importante elemento di design nel genoma Sc2.0 è l'introduzione di PCRTags, che servono come filigrane DNA per attivare il rilevamento di sintetico e selvaggio tipo DNA. PCRTags sono brevi segmenti ri-codificati in ORF sui cromosomi sintetici; mentre le sequenze PCRTag differiscono a livello di DNA tra i cromosomi tipo sintetico e selvatici, le proteine codificate sono identici in sequenza aminoacidica e, quindi, presumibilmente, funzione. Sequenze PCRTag sono specificamente progettati come Primer siti di legame per facilitare l'amplificazione selettiva (Figura 1A). Disegno PCRTag viene effettuata utilizzando l'algoritmo 'più diversa' in GeneDesign ^5,6, cedevole ricodificati sequenze sintetiche che sono tipicamente ~ 60% diversa dalle sequenze native (minimo 33%) con temperature di fusione tra 58 ° C e 60 ° C e amplicon lunghezze tra 200-500 coppie di basi ^2. Ricodifica non è consentito ai primi 100 bp di ciascuna ORF, come queste regioni sono noti perhanno preferenze particolari in termini di utilizzo codone ^7. Insieme, queste regole di progettazione favoriscono alte prestazioni di quasi tutti i PCRTags sotto un unico insieme di condizioni di PCR quale tipo PCRTag coppie di primer di sintesi e selvaggi legano esclusivamente e amplificano DNA sintetico e nativo, rispettivamente (Figura 1B).

Figura 1:. PCRTag schema (A) PCRTags sono sequenze all'interno di lettura aperta (ORF) dei geni sui cromosomi Sc2.0 ri-codificati. (B) sintetico (SYN) e wild type (WT) primer PCRTag legano esclusivamente e amplificano tipo sintetico e selvaggio DNA genomico (gDNA), rispettivamente. Qui è l'analisi di un segmento ~ 30 kb del braccio sinistro del cromosoma sei, prova tredici PCRTag coppie di primer utilizzando sia WT o semi-synVIL2 gDNA come modello. In molti casi un singolo ORF codifica più PCRTag. Presenza / assenza di ampliconi PCRTag viene valutata mediante elettroforesi su gel di agarosio. Ampliconi PCRTag variano nel formato da 200 bp a 500 bp. Le specie più veloce migrano nella parte inferiore dei pannelli sono dimeri di primer.

Analisi PCRTag ha dimostrato di essere uno strumento importante per l'assemblaggio di cromosomi Sc2.0. In un tipico esperimento 30-50 kb di DNA sintetico, che codifica 20-30 PCRTags, si trasforma in cellule di lievito per sostituire il corrispondente tipo selvaggio ^1,2,8 DNA. Analisi PCRTag viene poi utilizzato per identificare trasformanti che codificano PCRTags sintetici ma non selvaggio di tipo abbracciano quel segmento di DNA, o cosiddetti "vincenti". Di solito è necessario testare più trasformanti per identificare "vincitori", così la produttività e costi di analisi PCRTag sono considerazioni importanti. Attualmente due cromosomi Sc2.0 sono stati completati (synIII ¹ e synIXR ^2), che rappresentano meno del 10% del genoma Sc2.0, although più della metà dei rimanenti cromosomi sono attualmente in fase di sintesi e l'assemblaggio. La scala di analisi PCRTag necessaria per questo progetto sta rapidamente superando la possibilità di eseguire i gel e manualmente segnare la presenza di DNA sintetico e l'assenza di selvaggio tipo DNA.

Per migliorare il throughput del test PCRTag abbiamo sviluppato un flusso di lavoro mediante PCR in tempo reale per aggirare l'uso di gel di agarosio. Il flusso di lavoro si avvale di un distributore di rinfuse liquide distribuire qPCR mastermix in ciascun pozzetto di una piastra multipozzetto 1.536, un distributore di liquido acustico nanoscala per trasferire DNA stampo e primer, e un termociclatore 1.536 qPCR, che ci permette di miniaturizzare le reazioni di 500 nl e massimizzare il throughput. Inoltre l'analisi può essere automatizzata. Questo tipo di protocollo di genotipizzazione high throughput dovrebbe essere generalizzabili a qualsiasi progetto che richiede analisi di molti cloni di loci multipli.

Protocol

1. Preparare lievito DNA genomico (gDNA) Preparare uno stock di lievito Lysis Buffer 9 contenente 50 mM Tris pH 8,0, NaCl 100 mM, 1% SDS (w / v), 2% Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA pH 8,0. Come iniziare Uso dei materiali ~ 2 x 10 6 cellule, che corrisponde in genere a ~ 100 ml di cultura satura per i ceppi di laboratorio del 10 BY4741 sfondo. Cellule coltivate devono essere raccolte mediante centrifugazione a 1000 xg per 3 min a temperatura ambiente in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aspirare il surnatante. Aggiungere 200 ml di lievito Lysis Buffer e risospendere il pellet cellulare pipettando. Aggiungere ~ 300 microlitri di acido lavato perle di vetro tale che il livello di perline è di circa 1 mm al di sotto del livello della sospensione cellulare. In una cappa aspirante aggiungere 200 ml di fenolo / cloroformio / alcool isoamilico (25: 24: 1). Tappare la provetta per microcentrifuga e accertarsi che non perle sono bloccati tra il tappo e il tubo come questo si tradurrà in perdite durante l'agitazione(Passo 1.6). Invertire 3 volte per mescolare e verificare il tappo è sigillata. Agitare la provetta per 10 min a temperatura ambiente utilizzando un mixer da banco come un Eppendorf 5432. Centrifugare a 20.800 xg per 10 min a 4 ° C. Trasferimento 75 ml di fase acquosa in una nuova provetta da microcentrifuga contenente 1 ml di etanolo al 100%. Invertire 10 volte per mescolare. Pellet il DNA mediante centrifugazione a 20.800 xg per 20 min a 4 ° C. Aspirare il surnatante, senza staccare il pellet di DNA. Lavare il pellet con 500 ml di etanolo al 70%. Centrifugare a 20.800 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante, senza staccare il pellet di DNA e aria asciugare il pellet con il tappo microcentrifuga aperto fino eccesso di etanolo evaporato, che di solito è di circa 10 min. Risospendere il pellet di DNA in 75 ml di 10mM Tris pH 7.4 e agitare per miscelare. Conservare il campione a -20 ° C tempo indeterminato. Misurare la concentrazione di DNA nel campione utilizzando unBenchtop fluorimetro quali qubit, che distingue DNA da RNA. Assicurarsi che la concentrazione finale di gDNA è ~ 1-2 ng / ml. Preparare una diluizione 1:10 di DNA genomico con acqua e agitare per miscelare. Aliquotare 30 ml di gDNA diluito nel pozzetto di una piastra appropriata fonte che è compatibile con un dosatore acustica nanoscala (passaggio 3). Se si utilizza un Labcyte Echo 550, utilizzare una piastra in polipropilene 384 bene (targa 384PP). NOTA: quando sigillato appropriatamente questo piatto può essere conservato per almeno un mese a -20 ° C. 2. Preparare ed erogazione qPCR Master Mix in un piatto multiwell 1.536 Preparare 850 ml di qPCR master mix, come LightCycler 1536 DNA Verde Maestro, in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e agitare per miscelare. Centrifugare il master mix qPCR per 2 min a 20.800 xg a temperatura ambiente per eliminare eventuali bolle. I componenti della miscela master qPCR richiesto per una singola 1.536 piastra multipozzetto sono come seguonos: Combina 170 ml di master mix enzima (metropolitana di Green Master 1, 5x concentrato), 42,5 ml di SYBR (Verde Maestro Provetta 4, 20x concentrata) e 637,5 ml di acqua. Dispensare 500 nl / bene in un piatto di 1.536 pozzetti utilizzando un distributore di rinfuse liquide, come l'Arte Robbins Cobra. (Si noti che i passaggi 2.2.1-2.2.4 si riferiscono specificamente al Cobra.) Creare un programma di erogazione con le seguenti impostazioni: classe liquido, acqua; il volume aspirato, 800 ml; erogare il volume, 500 nl; lavare il tempo, 20 sec. Nelle impostazioni di erogazione, verificare la velocità di erogazione è impostato al 49,6 mm / sec, l'offset di erogazione è di 0,25 mm, liquido aspirato eccesso verrà erogata indietro nella fonte bene. Posizionare il tubo microcentrifuga contenente la master mix qPCR in pozzetto A1 del titolare provetta per microcentrifuga, che si trova in posizione di ponte 1. Tagliare il tappo della provetta per microcentrifuga o semplicemente lasciarla aperta. Impostare il 'Aspirare bene' per A1 modificando il AspiratImpostazioni e. Eseguire una fase di lavaggio prima di erogare qPCR master mix per primo de-selezionando l'aspirare e dispensare fasi del programma creato nel passo 2.2.2 e premendo 'run'. Una volta completato, riselezionare la aspirare e dispensare passaggi prima di eseguire il programma completo per erogare qPCR master mix. Se il Cobra è stato inattivo per meno di 10 minuti la fase iniziale di lavaggio, che serve per innescare il sistema, non è necessaria. Hit 'run' di dispensare qPCR Master Mix per ogni bene. Raccogliere il master mix qPCR in fondo a ogni bene da breve centrifugazione del 1536 piastra di pozzetti (30 sec con una bassa velocità PCR piatto ogiva). 3. Dispensare Template DNA e Primer nel 1.536 pozzetti Piastra Erogare 5 nl di gDNA diluito (passo 1.3) nei pozzetti desiderati della piastra multipozzetto 1536 utilizzando un sistema di trasferimento di liquido acustico, come l'Echo 550. Per il Echo 550, utilizzare il software Piastra Reformat o, in alternativa fornire un foglio di calcolo Excel personalizzato per programmare il trasferimento. Assicurarsi che la sorgente selezionata bene per il gDNA nel programma corrisponde alla fonte ben in cui si è fisicamente erogato il gDNA (passo 1,3). Scegliere la targhetta fonte '384PP_AQ_BP2', che indica il liquido nella piastra 384PP è un buffer senza tensioattivi. Erogare 10 nl di primer, pre-miscelati in avanti e inversa ad una concentrazione finale di 50 mM ciascuno, nei pozzetti desiderati della piastra multipozzetto 1536 utilizzando un sistema di trasferimento di liquido acustico, come l'Eco 550. Per il sistema di trasferimento di liquido, utilizzare il software Piastra Reformat o, in alternativa fornire un foglio di calcolo Excel personalizzato per programmare il trasferimento. NOTA: Qui è possibile erogare primers tale che il layout sulla piastra multipozzetto 1.536 corrisponde all'ordine cromosomico dei primer per cui è facile per ispezionare visivamente i risultati in tempo reale PCRsuccessivamente (fase 6). Premiscelare i primer in una piastra che è compatibile con l'erogatore liquido acustica. Per l'Eco 550, utilizzare una piastra Labcyte 384LDV (volume morto) e scegliere il tipo di piatto di origine '384LDV_AQ_B' durante la programmazione l'Eco per indicare il liquido è un semplice tampone senza proteine. 4. Seal e Centrifuga 1536 pozzetti Piastra Utilizzando un sistema sigillante micropiastre come il Plateloc Microplate Sealer termica, sigillare immediatamente la piastra multipozzetto 1.536 utilizzando otticamente chiaro sigillo che è compatibile con lo strumento termosaldatrice. Non toccare la superficie della guarnizione per evitare delle macchie. Se si utilizza il Plateloc termica Microplate Sealer, utilizzare le seguenti impostazioni: sigillare tempo 2,0 sec, temperatura di saldatura 162 ° C, la pressione dell'aria 82 psi. Questo strumento prende ~ 5 min a scaldarsi e quindi deve essere attivata in anticipo. Se si utilizza il Plateloc micropiastre termico sigillante, un adapter deve essere utilizzato per aumentare l'altezza del 1536 piastra multipozzetto sulla scena dello strumento per garantire una buona tenuta. NOTA: Anche se è preferibile acquistare un piattello per il Plateloc micropiastre termico sigillante, una soluzione alternativa è quella di inserire quattro ~ 2 mm di spessore rondelle standard disponibili in qualsiasi negozio di ferramenta negli angoli per aumentare l'altezza della piastra pozzetti 1.536. Centrifugare immediatamente la piastra multipozzetto sigillato 1.536 a 2.000 xg per 3 minuti a temperatura ambiente per raccogliere tutti i reagenti sul fondo di ciascun pozzetto. 5. Real Time PCR Programma uno strumento 1.536 qPCR, come il LightCycler 1536, con un protocollo di amplificazione due fasi seguita da una analisi della curva di fusione. Utilizzando il software LightCycler 1.536 istituito un programma come segue: Pre-incubazione: 95 ° C, 1 min di attesa, velocità di rampa 4,8 ° C / sec, nessun acquisto. Two Step Amplificazione: 30 cicli di [95 ° C, nessuna attesa,rampa tasso 4,8 ° C / sec, nessuna acquisizione; 64 ° C, 30 sec attesa, velocità di rampa 2.5 ° C / sec, singola acquisizione]. Melt curva: 95 ° C, 10 sec, velocità di rampa 4,8 ° C / sec, nessuna acquisizione; 60 ° C, 1 min, velocità di rampa 2.5 ° C / sec, senza acquisizione; 97 ° C, velocità di rampa di 0,1 ° C / sec, 5 acquisizioni / ° C (continuo). Raffreddare: 40 ° C, 30 sec, velocità di rampa 2.5 ° C / sec, senza acquisizione. Impostare il formato di rilevamento di 'Green intercalando Dye' nella scheda Run Definizione. Impostare il controllo di pipettaggio di 'Master Control' nella scheda Run Definizione. Questa funzione serve come controllo interno e rileva la presenza di qPCR master mix in ciascun pozzetto della piastra multipozzetto 1.536, che è utile identificare putativi falsi negativi. Inserire la piastra di 1.536 pozzetti preparato in passi 2-4 nello strumento 1.536 qPCR ed eseguire il programma. Analisi 6. Dati Perform ispezione visiva dei dati all'interno del software qPCR. NOTA: Il software 1.536 permette la visualizzazione sia amplificazione e fondere curve, così come una mappa di calore che mostra la chiamata (positivo, negativo, non valida, N / A, figura 2), il valore del punto di attraversamento (scorrevole scala colori per positiva o grigio per negativo; Figura 3), o una fluorescenza endpoint (EPF) valore (scalare colore). Esportare dati dal software 1.536 sotto forma di un file txt (tabella dei risultati) o un file .xml sia con i dati grezzi o dati calcolati per l'elaborazione offline dallo strumento. NOTA: Il proprietario punto di attraversamento automatizzato (Cp) algoritmo chiamando integrato nel software 1.536 prende in considerazione la forma e la pendenza della curva di amplificazione durante la determinazione / chiamate valore negativo e Cp positive con fiducia alta, a volumi di reazione microlitro basso sub con relativamente basso valori di fluorescenza. Se il DNA LightCycler Verde Maestro era usod per qPCR, verificare che tutti i pozzetti superato il 'controllo master'. Un fail indica il bene non ha ricevuto qPCR master mix e il punto di dati mancanti dovrebbe essere considerata un potenziale falso negativo. Verificare che tutti i pozzetti superato il 'controllo master'. Un fail indica il bene non ha ricevuto Mastermix DNA e considerare il punto di dati mancanti un potenziale falso negativo.

Representative Results

Abbiamo testato sintetico e selvaggio tipo cromosoma 3 PCRTag coppie di primer 1 con il lievito DNA genomico (gDNA) estratto da quattro diversi ceppi. Cromosoma 3 ha 186 PCRTag coppie di primer che si estendono la lunghezza del cromosoma (synIII è ~ 270 kb e selvaggio tipo cromosomiche 3 è ~ 315 kb). Per testare ciascuno dei quattro ceppi con entrambe le serie di primer, abbiamo diviso la piastra multipozzetto in quattro quadranti, uno per ogni tipo di gDNA, assegnando primers sintetici PCRTag alla metà superiore di ogni quadrante e tipo selvaggio per la metà inferiore. Il DNA genomico è stato estratto dai ceppi di lievito, due dei quali codificano wild type cromosoma 3 (wild type, synIXR 2), mentre i restanti due codifica cromosoma sintetico 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR master mix è stato erogato in ciascun pozzetto di una piastra multipozzetto 1.536 con un dosatore di massa, seguito da gDNA e PCRTag primer utilizzando le Echo 550. primer sono stati schierati in modo identicoogni quadrante della piastra di pozzetti per un facile confronto visivo. La piastra pozzetti è stato poi termosaldato con guarnizione otticamente chiaro e sottoposto ad real time PCR. In questo esperimento qPCRTag abbiamo osservato, per la maggior parte, di amplificazione come previsto, per cui primers sintetici esclusivamente amplificate DNA sintetico e viceversa (figure 2 e 3). Tuttavia, abbiamo anche osservato diverse deviazioni dal modello previsto, suggerendo falsi negativi e falsi positivi nel dataset. In questo esperimento, la centralina è stata rilevata nel 100% dei pozzi, indicando il dosatore bulk erogato successo mastermix in ogni pozzetto della piastra (dati non mostrati). Questo esclude un potenziale fonte di falsi negativi. Inoltre, alcuni dei cromosomi 3 PCRTags sono noti a fallire (indicato nelle figure S6 e S7 di Annaluru et al. 1), di cui almeno 2 SYN e 1 WTcoppie di primer; quindi questi pozzi possono essere ignorati in ogni quadrante. Veri falsi negativi potrebbero derivare da una mancanza di trasferimento di template gDNA o primer, però nella nostra esperienza, data la corretta taratura della Echo 550, così come la preparazione di gDNA e primer come descritto, questo non è stato un importante fonte di errore. Nel complesso in questo esperimento il tasso di falsi negativi è stato estremamente basso per primer WT con modello WT (~ 2%), anche se leggermente superiore per i primer SYN con SYN DNA (~ 8%). I falsi positivi, il rilevamento di segnali in pozzi dove primers SYN sono mescolati con WT gDNA (e viceversa), possono derivare da amplificazione croce o dimeri di primer. Infatti, dimeri di primer sono spesso visibili mediante elettroforesi su gel (Figura 1B) e rappresentano una fonte di errore ragionevole. Per l'applicazione della qPCR, l'esame delle curve di fusione può essere utile per determinare se diverse specie, come dimeri di primer, possono contribuire a un segnale. Inoltre, performing un esperimento di controllo per cui primer sono dispensati in assenza del DNA stampo può aiutare a identificare primer con una propensione a dimerize. Amplificazione trasversale può essere osservata mediante elettroforesi su gel, in particolare se troppi cicli di PCR vengono eseguite o se la temperatura di ricottura è troppo bassa. Si è cercato di ridurre il numero di falsi positivi dovuta all'amplificazione croce ottimizzando entrambi questi parametri per il protocollo qPCRTag. Infine, esaminando i valori valico (Cp) per ciascun bene può aiutare a identificare primer che non sono adatti al rilevamento basato su tempo reale (figura 3, per esempio, BB22, FB22, BB46, Fb46). Nel complesso in questo esperimento il tasso di falsi positivi è stato basso per primer SYN con modello WT (~ 5%) e superiore per primer WT con template SYN (~ 10%). Figura 2: Piastra mappa di calore visualizzazione presenza / abinvito indicationi per un esperimento qPCRTag. Quattro diversi tipi di DNA genomico (quadranti separati da linee bianche solide) sono stati sottoposti ad analisi PCRTag usando sintetica (SYN) e wild type (WT) cromosoma 3 primer PCRTag (tratteggiate linee bianche per separare SYN (top ) e WT (inferiore) in ogni quadrante). WT e synIXR gDNA codificano selvaggio tipo cromosoma 3, cedendo l'amplificazione con primer WT PCRTag. SynIII e synIII synIXR gDNA codificano cromosoma sintetico 3, cedendo l'amplificazione con primer SYN PCRTag. Primer sono disposte in base al loro posizionamento cromosomica da sinistra a destra e posizionate in modo identico nei quattro quadranti per il confronto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3: di calore a piastremappa mostrando valico (Cp) valore per un esperimento qPCRTag. Questo è lo stesso insieme di dati, come in figura 2 e il layout di piastra è quindi identica. N / A si riferisce a 'nessuna amplificazione'. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Incorporazione di tempo reale di rilevamento PCR nel test di genotipizzazione PCRTag è uno sviluppo importante per il progetto Sc2.0 in quanto consente un throughput significativamente più alto. Il flusso di lavoro precedente specificato di 2,5 microlitri reazioni in 384 piatti ben PCR, 1,5 ore di runtime cicli termici, elettroforesi gel, e annotazione manuale del gel.

Il flusso di lavoro qui presentato, chiamata analisi qPCRTag, supera diversi grandi colli di bottiglia. In primo luogo, una corsa qPCRTag condensa 4 x 384 pozzetti in un singolo esperimento che può essere elaborato, dall'inizio alla fine (targa impostare più il tempo di esecuzione), in circa un'ora. E 'significativo notare che il costo dei reagenti per pozzetto per l'analisi qPCRTag è alla pari con l'approccio basato gel agarosio rendimento inferiore. Tuttavia, eludendo elettroforesi su gel e annotazione manuale, il flusso di lavoro qPCRTag permette notevoli risparmi di tempo e manodopera, che sono i principali vantaggi. È importante sottolineare che il flusso di lavoro qPCRTag è enramente compatibile con l'automazione.

Una preoccupazione principale con l'uso della rilevazione in tempo reale come uscita del test PCRTag è il tasso di falsi positivi e falsi negativi. Poiché i primers PCRTag non sono stati originariamente progettati per l'utilizzo in tempo reale PCR, si prevede che non tutte le coppie di primer sarà appropriato per l'uso con questa uscita. A tal fine è importante per convalidare la funzione e la specificità di tutte le coppie di primer PCRTag escludere il sottoinsieme che non funzionano nel reale test basato sul tempo davanti. Per esempio, cromosoma 3 PCRTag falsi positivi e negativi sono by-e-grandi riproducibile in tempo reale di dati PCR (figure 2 e 3), e questi possono essere esclusi da ulteriori analisi. Inoltre, coppie di primer noti per fallire (valutato mediante elettroforesi su gel e riportati nelle figure S6 e S7 di Annaluru et al. ¹⁾ può anche essere esclusa. Questo è facilmente realizzabile semplicemente excluding le coppie di primer difettosi durante la configurazione del protocollo di trasferimento acustico.

Come la maggior parte saggi ad alto rendimento, abbiamo intenzione di utilizzare il rilevamento PCRTag tempo reale come schermo primario per identificare trasformanti che meritano ulteriore convalida valle. Successivamente, il gold standard per lo screening secondario rimarrà analisi PCRTag con elettroforesi su gel come la lettura. Al di là l'applicazione dell'analisi PCRTag per Sc2.0, combinando sistemi di manipolazione su scala nanometrica liquido state-of-the-art, con un throughput elevato tempo reale tecnologia PCR consente analisi rapide e automatizzato e ha il potenziale per influenzare molti campi. Ad esempio, questo flusso di lavoro potrebbe essere applicata ad alto throughput screening biblioteca, la diagnosi delle malattie infettive, l'analisi microbioma e all'avanguardia di editing genoma approcci di tentare di modificare simultaneamente loci multipli.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Science Foundation sovvenzione MCB-0718846 e della Difesa Advanced Research Projects Agency Contratto N66001-12-C-4020 (per JDB). LAM è stato finanziato da una borsa di studio post-dottorato dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada. La pubblicazione di questo articolo è sponsorizzato da Roche.

Materials

			Yeast gDNA prep
yeast gDNA	custom	custom	template for real time PCR
Acid-washed glass beads (0.5mm)	Sigma	G8772	yeast cell lysis
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)	Invitrogen	15593-031	yeast cell lysis
5432 Mixer	Eppendorf	5432	yeast cell lysis
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	22621807	yeast cell lysis
Qubit 3.0 Fluorometer	Life Technologies	Q33216	gDNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Life Technologies	Q32850	gDNA quantification
Labcyte 384PP plate	Labcyte	P-05525	gDNA source plate

			DNA Green Mastermix prep and dispensing
LightCycler 1536 DNA Green	Roche	5573092001	real time PCR mastermix
1.5mL Microfuge Tube Holder	ARI	EST BD060314-1	microfuge tube holder for deck of Cobra
LightCycler 1536 Multiwell Plate	Roche	5358639001
Cobra liquid handling system	Art Robbins Instruments	630-1000-10	dispense qPCR master mix into 1536 plate
PCR Plate Spinner	VWR	89184-608	cenrifugation of 1536 plate

			Template and primer dispensing
PCRTag primers	IDT	custom	premixed forward and reverse, [50uM] each
TempPlate pierceable sealing foil, sterile	USA Scientific	2923-0110	temporary seal for PCRTag primer plates
Labcyte LDV 384 well plate	Labcyte	LP-0200	pre-mixed primer source plate
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte		transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate
Plateloc Thermal Microplate Sealer	Agilent	G5402-90001	heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run
Clear Permanent Seal	Agilent	24212-001	optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage	Agilent	G5402-20008	can substitute ~2mm thick washers
Sorvall Legend XTR	Thermo Scientfic	75-004-521	centrifuge heat sealed 1536 plate
Industrial Air Compressor	Jun Air	1795011	to run the Echo and Heat Sealer

			Real Time PCR
LightCycler 1536	Roche		requires 220V outlet

References

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Mitchell, L. A., Phillips, N. A., Lafont, A., Martin, J. A., Cutting, R., Boeke, J. D. qPCRTag Analysis – A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping. J. Vis. Exp. (99), e52941, doi:10.3791/52941 (2015).