qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Leslie A. Mitchell; Nick A. Phillips; Andrea Lafont; James A. Martin; Rupal Cutting; Jef D. Boeke

doi:10.3791/52941

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biologie

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

Published: May 25, 2015

doi:

10.3791/52941

Leslie A. Mitchell¹, Nick A. Phillips¹, Andrea Lafont², James A. Martin¹, Rupal Cutting², Jef D. Boeke¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,Institute for Systems Genetics, ²Roche Life Science, USA

Summary

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Abstract

פרויקט הגנום סינטטי השמרים (Sc2.0) שמטרתו לבנות 16 שמרי הכרומוזומים מעצב ולשלב אותם לתוך שמרי תא בודד. עד כה כרומוזום אחד סינטטי, ¹ synIII, וזרוע כרומוזום סינתטית אחד, synIXR ^2, נבנה ותפקודם בvivo תוקף בהעדר כרומוזומים מהסוג בר המקביל. תכונת עיצוב חשובה של כרומוזומים Sc2.0 היא המבוא של PCRTags, שהם רצפים בתוך מסגרות פתוחות קריאה (ORFs) המאפשרות בידול של כרומוזומים סינטטיים מעמיתי הסוג הברים קצרים, בקידוד מחדש. PCRTag פריימרים לחשל סלקטיבי לשני כרומוזומים מסוג סינטטיים או פראיים ונוכחות / היעדרות של כל סוג של DNA ניתן לבדוק באמצעות assay PCR פשוט. את ההודעה סטנדרטית של assay PCRTag הוא להעריך נוכחות / היעדר amplicons ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. עם זאת, עם צפיפות amplicon PCRTag ממוצעת של אחת ל1.5 kb וAGenome גודל ~ 12 Mb, הגנום Sc2.0 הושלם יהיה לקודד כ -8,000 PCRTags. כדי לשפר את התפוקה, פיתחנו assay זיהוי מבוסס PCR בזמן אמת עבור genotyping PCRTag שאנו מכנים ניתוח qPCRTag. העבודה מציינת 500 תגובות NL בצלחת multiwell 1,536, ומאפשר לנו לבדוק עד 768 PCRTags עם שני זוגות פריימר הסוג סינטטיים ופראיים בניסוי יחיד.

Introduction

Sc2.0, או פרויקט הגנום סינטטי שמרים (www.syntheticyeast.org), יש להגדיר את המטרה של תכנון ובניית הגנום סינטטי אוקריוטים לחלוטין. באמצעות רצף הגנום אצר ביותר של cerevisiae Saccharomyces ³ כנקודת התחלה, כל אחד מהכרומוזומים יניארי שש עשרה כבר מחדש נועד לענות סט של עקרונות עיצוב שיציינו שמירה על כושר תא, שיפור יציבות הגנום, והגדלת גמישות גנטית. לדוגמא, אלמנטים כגון חוסר יציבות חוזר נמחקים מהכרומוזומים Sc2.0. כל המופעים של קודונים תחנת TAG מחדש מקודדים לTAA ל'לפנות 'קודון במתח הסופי לכניסתה של חומצת אמינו שאינו מקודדת גנטי. בנוסף מערכת מושרה אבולוציה, מירוץ, מופעלת על ידי מערכת Cre-לקס, מאפשרת יכולת חסרת תקדים ליצירת הגנום נגזר עם מבני רומן ^4.

<p class="Jove_content"> אלמנט עיצוב מרכזי נוסף בגנום Sc2.0 הוא המבוא של PCRTags, המשמש כסימני מי DNA כדי לאפשר מעקב של ה- DNA הסינתטי והפראי הסוג. PCRTags הם מגזרים בORFs על כרומוזומים סינטטיים קצרים, בקידוד מחדש; בעוד רצפי PCRTag שונים ברמת ה- DNA בין כרומוזומים סינטטיים ופראיים סוג, החלבונים המקודדים זהים ברצף חומצות אמינו ולכן, ככל הנראה, תפקיד. רצפי PCRTag נועדו במיוחד כאתרי קישור פריימר כדי להקל על הגברה סלקטיבית (איור 1 א). עיצוב PCRTag מתבצע באמצעות האלגוריתם "רוב שונה" בGeneDesign ^5,6, מניב recoded רצפים סינטטיים שהם בדרך כלל ~ 60% שונים מרצפי ילידים (33% מינימום) עם טמפרטורות התכה בין 58 ° C ו 60 ° C ו amplicon אורכים בין 200-500 זוגות בסיסים ^2. Recoding אינו מותר בכל ORF 100 נ"ב הראשון, כאזורים אלה ידועיםיש העדפות מיוחדות במונחים של שימוש קודון ^7. יחד, כללי עיצוב אלה מעדיפים ביצועים גבוהים של כמעט כל PCRTags תחת קבוצה אחת של תנאי PCR לפי זוגות פריימר PCRTag הסוג סינטטיים ופראיים באופן בלעדי לאגד ולהגביר DNA הסינתטי וילידים, בהתאמה (איור 1).

איור 1:. סכמטי PCRTag PCRTags () מחדש מקודד רצפים בתוך מסגרות פתוחות קריאה (ORF) של גנים על כרומוזומים Sc2.0. סינטטי (ב) (SYN) ופריימרים PCRTag סוג בר (WT) באופן בלעדי לאגד ולהגביר הדנ"א הגנומי סוג סינטטי ופראי (gDNA), בהתאמה. מוצג כאן הוא ניתוח של קטע KB ~ 30 של הזרוע השמאלית של כרומוזום שש, בודק שלוש עשרה זוגות פריימר PCRTag או באמצעות WT או חצי synVIL2 gDNA כתבנית. במקרים רבים ORF אחד מקודד P יותר מאחדCRTag. נוכחות / היעדר amplicons PCRTag נבחנים באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose. amplicons PCRTag הטווח בגודל מ 200 נ"ב ל -500 נ"ב. המינים הנודדים מהר יותר בחלק התחתון של הפנלים הם הדימרים פריימר.

ניתוח PCRTag הוכיח להיות כלי חשוב בהרכבה של כרומוזומים Sc2.0. בניסוי 30-50 קילו טיפוסי של ה- DNA הסינתטי, קידוד 20-30 PCRTags, הופך לתאי שמרים להחליף את הסוג בר המקביל DNA ^1,2,8. ניתוח PCRTag לאחר מכן נעשה שימוש כדי לזהות transformants שלקודד PCRTags הסוג סינטטי אבל לא פראי פורש קטע זה של ה- DNA, או מה שנקרא "מנצחים". זה בדרך כלל צורך לבדוק transformants מרובה כדי לזהות זוכי ", כך תפוקה ועלות של ניתוח PCRTag הן שיקולים חשובים. נכון לעכשיו שני כרומוזומים Sc2.0 הושלמו (synIII ¹ וsynIXR ^2), המייצגים פחות מ -10% מהגנום Sc2.0, altהאף יותר ממחצית הכרומוזומים שנותרו כעת בתהליך סינתזה והרכבה. הסולם של ניתוח PCRTag הנדרש לפרויקט זה outpacing מהר את היכולת להפעיל ג'לי וידני להבקיע את נוכחותו של ה- DNA והעדר DNA סוג בר סינטטיים.

על מנת לשפר את התפוקה של assay PCRTag פיתחנו זרימת עבודה באמצעות PCR בזמן אמת לעקוף את השימוש בג'ל אלקטרופורזה agarose. העבודה עושה שימוש במתקן נוזל בכמות גדולה להפצת mastermix qPCR לבאר כל צלחת multiwell 1,536, מנפק נוזל אקוסטית ננו להעביר תבנית ה- DNA ופריימרים, וCycler תרמית 1,536 qPCR, ומאפשרת לנו למזער תגובות 500 NL ו למקסם את התפוקה. יכול להיות אוטומטי ניתוח יתר על כן. סוג זה של פרוטוקול genotyping תפוקה גבוהה צריכה להיות להכליל לכל פרויקט הדורש ניתוח של שיבוטים רבים בלוקוסים מרובים.

Protocol

1. הכן את ה- DNA הגנומי שמרים (gDNA) הכן מלאי של שמרי תמוגה הצפת 9 המכיל 50 מ"מ טריס pH 8.0, 100 מ"מ NaCl, 1% SDS (w / v), 2% Triton X-100 (V / V), 1 mM EDTA pH 8.0. כהחל שימוש בחומרים ~ 2 x 10 6 תאים, אשר בדרך כלל מתאים ל~ 100 μl של תרבות רוויה למעבדת זנים של הרקע BY4741 10. תאים בתרבית צריכים להיות שנאספו על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 3 דקות בטמפרטורת חדר בצינור 1.5 מיליליטר microfuge. לשאוב supernatant. הוסף 200 μl של שמרי תמוגה הצפת וresuspend התא גלולה על ידי pipetting. להוסיף ~ 300 μl של החומצה שטפה חרוזי זכוכית כך שהרמה של חרוזים היא כ 1 מ"מ מתחת לרמה של תרחיף התאים. במנדף להוסיף 200 μl של פנול / כלורופורם / isoamyl אלכוהול (25: 24: 1). שווי צינור microfuge ולהבטיח כי לא חרוזים תקועים בין הכובע והצינור כמו זה יגרום הדלפות במהלך רועד(שלב 1.6). הפוך 3 פעמים כדי לערבב ולאמת את הכובע אטום. לנער את הצינור במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר בעזרת מערבל benchtop כגון אפנדורף 5432. צנטריפוגה ב 20,800 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העברה 75 μl של השלב המימי לצינור microfuge חדש המכיל 1 מיליליטר של 100% אתנול. הפוך 10 פעמים כדי לערבב. גלולה DNA על ידי צנטריפוגה ב20,800 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוב supernatant ללא פירוק גלולה DNA. שטוף את הכדור עם 500 μl של 70% אתנול. צנטריפוגה ב 20,800 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוב supernatant ללא פירוק גלולה DNA ואוויר יבש גלולה עם כובע microfuge הפתוח עד אתנול עודף התאדה, שהיא בדרך כלל סביב 10 דקות. Resuspend גלולה DNA ב -75 μl של 10mm טריס pH 7.4 ו מערבולת לערבב. חנות המדגם ב -20 ° C ללא הגבלת זמן. למדוד את הריכוז של ה- DNA במדגם באמצעותbenchtop fluorimeter כגון קיוביט, אשר מבדיל את ה- DNA מRNA. ודא שהריכוז הסופי של gDNA הוא ~ 1-2 ng / μl. הכן דילול 1:10 של הדנ"א הגנומי שימוש במים ומערבולת לערבב. Aliquot 30 μl של gDNA המדולל לתוך הבאר המתאימה צלחת מקור שתואמת עם מתקן ננו אקוסטית נוזלי (שלב 3). אם באמצעות Labcyte אקו 550, השתמש בצלחת 384 גם פוליפרופילן (צלחת 384PP). הערה: כאשר אטום כראוי צלחת זה יכול להיות מאוחסן במשך חודש אחד לפחות ב -20 ° C. 2. הכן ולוותר qPCR מיקס מאסטר לצלחת multiwell 1,536 הכן 850 μl של תערובת אמן qPCR, כגון LightCycler 1,536 DNA ירוק הורים, בצינור 1.5 מיליליטר microfuge ומערבולת לערבב. צנטריפוגה תערובת אמן qPCR 2 דקות ב20,800 XG בטמפרטורת חדר כדי להסיר כל בועות. הרכיבים של מיקס מאסטר qPCR נדרש לצלחת multiwell אחת 1,536 הם כדלקמןS: לשלב 170 μl של תערובת אמן אנזים (Tube מאסטר הירוק 1, 5x מרוכז), 42.5 μl של SYBR (Tube מאסטר הירוק 4, 20x המרוכז), ו637.5 μl של מים. לוותר 500 NL / גם לתוך צלחת multiwell 1,536 באמצעות מתקן נוזל בתפזורת כגון אמנות רובינס קוברה. (שים לב שצעדים 2.2.1-2.2.4 מתייחסים באופן ספציפי לקוברה.) ליצור תכנית מחלק עם ההגדרות הבאות: כיתת נוזל, מים; לשאוב נפח, 800 μl; לוותר נפח, NL 500; לשטוף זמן, 20 שניות. בהגדרות לוותר, לאמת את המהירות לוותר מוגדרת 49.6 מ"מ / שנייה, לוותר על הקיזוז הוא 0.25 מ"מ, ונוזל aspirated עודף להימכר חזרה למקור גם. מניחים את צינור microfuge המכיל תערובת אמן qPCR היטב A1 של בעל צינור microfuge, הנמצא בעמדת סיפון 1. חותך את הכובע של צינור microfuge או פשוט להשאיר את זה פתוח. הגדר את 'לשאוב גם' לA1 על ידי עריכת Aspiratהגדרות דואר. לבצע צעד לשטוף לפני ניפוק תערובת אמן qPCR על ידי צעדים לשאוב ולוותר בחירה-דה הראשונים של התכנית להקים בשלב 2.2.2 ואז להכות "לרוץ". ברגע מלא, לבחור מחדש לשאוב ולוותר צעדים לפני הפעלת התכנית המלאה לוותר תערובת אמן qPCR. אם קוברה כבר יושב פעיל במשך פחות מ -10 דקות השלב לשטוף הראשוני, המשמשת לראש המערכת, הוא מיותר. הכה 'ריצה' לוותר תערובת אמן qPCR היטב כל אחד. לאסוף את תערובת אמן qPCR בחלק התחתון של כל טוב על ידי צנטריפוגה הקצרה של 1,536 צלחת multiwell (סעיף 30 באמצעות טווה צלחת במהירות נמוכה PCR). 3. לוותר תבנית ה- DNA ויחל לצלחת multiwell 1,536 לוותר 5 NL של gDNA המדולל (שלב 1.3) לתוך הבארות הרצויות של צלחת multiwell 1,536 באמצעות מערכת העברת נוזל אקוסטית, כגון אקו 550. ל"איכסo 550, להשתמש בתוכנה לאתחל מחדש פלייט או לחלופין לספק גיליון אלקטרוני Excel מותאם אישית לתכנת את ההעברה. להבטיח המקור שנבחר גם לgDNA בתכנית תואמת את המקור טוב שליש לך לוותר פיזי gDNA (שלב 1.3). בחר את סוג צלחת המקור '384PP_AQ_BP2', אשר מציין את הנוזל בצלחת 384PP הוא חיץ ללא חומרים פעילי שטח. לוותר 10 NL של פריימרים, מעורב מראש קדימה הפוך לריכוז סופי של 50 מיקרומטר כל, לתוך הבארות הרצויות של צלחת multiwell 1,536 באמצעות מערכת העברת נוזל אקוסטית, כגון אקו 550. למערכת ההעברה הנוזלית, השתמש בתוכנה לאתחל מחדש פלייט או לחלופין לספק גיליון אלקטרוני Excel מותאם אישית לתכנת את ההעברה. הערה: כאן אפשר לוותר פריימרים כך שהפריסה על צלחת multiwell 1,536 תואמת את סדר כרומוזומליות של פריימרים כל כך קל לבדוק חזותי את תוצאות PCR בזמן אמתמאוחר יותר (שלב 6). Premix פריימרים בצלחת שתואמת את מתקן הנוזל אקוסטית. לאקו 550, השתמש בצלחת Labcyte 384LDV (נפח מת נמוך) ולבחור את סוג צלחת המקור '384LDV_AQ_B' בעת תכנות אקו כדי לציין את הנוזל הוא חיץ פשוט ללא חלבונים. 4. חותם וצנטריפוגה צלחת multiwell 1,536 שימוש במערכת אוטם microplate כגון אוטם microplate התרמי Plateloc, לאטום מייד את צלחת multiwell 1,536 באמצעות חותם ברור אופטי שתואם למכשיר אוטם חום. אל תגעה בשטח החותם כדי למנוע סימני מריחה. אם באמצעות microplate אוטם התרמי Plateloc, להשתמש בהגדרות הבאות: לאטום זמן 2.0 שניות, טמפרטורת חותם 162 מעלות צלזיוס, לחץ אוויר 82 psi. מכשיר זה לוקח ~ 5 דקות להתחמם וכך צריך להיות מופעל מראש. אם משתמש באוטם microplate התרמי Plateloc, adapter יש להשתמש כדי להעלות את גובה צלחת multiwell 1,536 על הבמה של המכשיר כדי לוודא איטום טוב. הערה: למרות שזה עדיף לרכוש צלחת שלב לאוטם microplate התרמי Plateloc, פתרון חלופי הוא להכניס ארבעה ~ 2 מ"מ מכונות כביסה סטנדרטית עבה זמינה בכל חנות לחומרי בניין בפינות להעלות את הגובה של צלחת multiwell 1,536. מייד צנטריפוגות צלחת 1,536 multiwell אטומה XG ב 2000 במשך 3 דקות בטמפרטורת חדר כדי לאסוף את כל חומרים כימיים בחלק התחתון של כל טוב. 5. Real Time PCR תכנית מכשיר 1,536 qPCR, כגון 1,536 LightCycler, עם פרוטוקול הגברה שני שלבים אחרי ניתוח עקום להמיס. שימוש בתוכנת LightCycler 1,536 להגדיר תכנית כדלקמן: טרום דגירה: 95 מעלות צלזיוס, אחיזת 1 דקות, שיעור רמפה 4.8 מעלות צלזיוס / sec, אין רכישה. שני שלב הגברה: 30 מחזורים של [95 ° C, אין לו אחיזה,רמפה 4.8 מעלות צלזיוס / sec שיעור, אין רכישה; 64 מעלות צלזיוס, אחיזת 30 שניות, קצב רמפה 2.5 מעלות צלזיוס / sec, רכישה אחת]. עקום להמס: 95 ° C, 10 שניות, קצב רמפה 4.8 מעלות צלזיוס / sec, אין רכישה; 60 מעלות צלזיוס, 1 דקות, שיעור רמפה 2.5 מעלות צלזיוס / sec, אין רכישה; 97 מעלות צלזיוס, קצב רמפה 0.1 מעלות צלזיוס / sec, 5 רכישות / ° C (הרציף). מגניב: 40 מעלות צלזיוס, 30 שניות, קצב רמפה 2.5 מעלות צלזיוס / sec, אין רכישה. הגדר את פורמט איתור ל'גרין דיי intercalating 'בכרטיסיית הגדרת הפעלה. הגדר את שליטת pipetting ל'מאסטר בקרה 'בכרטיסיית הגדרת הפעלה. תכונה זו משמשת כבקרה פנימית ומזהה את הנוכחות של תערובת אמן qPCR בכל טוב של צלחת multiwell 1,536, אשר היא שימושי כדי לזהות שליליים שווא משוער. הכנס את צלחת multiwell 1,536 הוכנה בשלבי 2-4 למכשיר qPCR 1,536 ולהפעיל את התכנית. ניתוח 6. נתונים PerfORM בדיקה ויזואלית של נתונים בתוך תוכנת qPCR. הערה: תוכנת 1,536 מאפשרת הדמיה של שתי ההגברה ולהמס עקומות, כמו גם מפת חום מציגה את השיחה (N / חיובי, שלילי, לא חוקי,; איור 2), ערך נקודת מעבר (הזזה בקנה מידה צבע לחיובי או אפור לשלילי; איור 3), או ערך הקרינה נקודות קצה (EPF) (הזזה בקנה מידה צבע). נתוני יצוא מהתוכנה 1,536 בצורת קובץ txt (טבלת תוצאות) או קובץ XML עם או נתונים הגולמיים או נתונים מחושבים לעיבוד מחובר מהמכשיר. הערה: נקודת הקניינית האוטומטית מעבר אלגוריתם קורא (CP) שנבנתה לתוך תוכנת 1,536 לוקחת בחשבון את הצורה ושיפוע העקום ההגברה תוך קביעת שיחות חיוביות / שליליות וCp ערך עם ביטחון גבוה, בהיקפים נמוכים תת תגובת microliter עם נמוך יחסית ערכי הקרינה. אם LightCycler DNA הירוק מאסטר היה שימושד לqPCR, לוודא שכל הבארות עברו 'בקרת ההורים'. Fail מציין גם לא קיבלו תערובת אמן qPCR ונקודת נתונים החסרה, צריכה להיחשב שלילית כוזב פוטנציאלית. ודא שכל הבארות עברו 'בקרת ההורים'. Fail מציין גם לא קיבל mastermix DNA ולשקול את נקודת הנתונים החסרה שלילי כוזב פוטנציאלית.

Representative Results

בדקנו כרומוזום סינטטי ופראי סוג 3 זוגות פריימר PCRTag 1 עם DNA הגנומי שמרים (gDNA) המופק מארבעה זנים שונים. יש כרומוזום 3 186 זוגות PCRTag פריימר כי היקף אורכו של כרומוזום (synIII הוא ~ 270 KB וכרומוזום מסוג בר 3 הוא ~ 315 KB). כדי לבדוק כל אחד מהזנים ארבעה עם שני הסטים של פריימרים, חילקנו את צלחת multiwell לארבעה רבעים, אחד לכל סוג של gDNA, הקצאת פריימרים PCRTag סינטטיים למחצית העליונה של כל רבע והסוג בר למחצית התחתונה. הדנ"א הגנומי הופק מזני השמרים, שניים מהם לקודד סוג בר כרומוזום 3 (סוג בר, synIXR 2), ואילו כרומוזום נותר שני לקודד הסינתטי 3 (1 synIII, synIII synIXR). תערובת אמן qPCR הייתה לוותר לבאר כל צלחת multiwell 1,536 באמצעות מתקן נוזל בכמות גדולה, ואחריו פריימרים gDNA וPCRTag באמצעות אקו 550. Primers היו ערוכים באופן זהה בכל רבע של צלחת multiwell להשוואה ויזואלית קלה. צלחת multiwell אז חום אטום עם חותם ברור אופטי ונתונים לניתוח PCR בזמן אמת. בניסוי זה אנו qPCRTag נצפו, לחלק, ההגברה ביותר כצפוי, לפי פריימרים סינטטיים באופן בלעדי מוגברים DNA סינטטי ולהיפך (איורים 2 ו -3). עם זאת, אנחנו גם נצפו מספר חריגות מהתבנית הצפויה, מה שמרמז שליליים שווא וחיובי שגויים בבסיס הנתונים. בניסוי זה, יחידת הבקרה התגלתה בבארות 100%, המצביעה על מתקן נוזל בכמות גדולה לוותר בהצלחה mastermix לכל גם על הצלחת (מידע לא מוצג). זה פוסל את המקור פוטנציאלי אחד נגטיבים שווא. בנוסף, חלק 3 PCRTags כרומוזום ידוע להיכשל (מוצג בS6 דמויות וS7 של Annaluru et al. 1), ובם לפחות 2 SYN ו1 WTזוגות פריימר; כך ניתן להתעלם מן הבארות אלה בכל רבע. שליליים שווא אמיתי יכול לנבוע ממחסור בהעברת gDNA תבנית או פריימרים, אולם בחוויה שלנו, בהתחשב בכיול הנכון של אקו 550, כמו גם הכנת gDNA ופריימרים כפי שתואר, זה לא היה מקור עיקרי לשגיאה. בסך הכל בניסוי זה השיעור השלילי הכוזב היה נמוך מאוד לפריימרים WT עם תבנית WT (~ 2%) אם כי מעט גבוה יותר עבור פריימרים SYN SYN עם DNA (~ 8%). תוצאות חיוביות שגויות, זיהוי של אות בבארות בי פריימרים SYN מעורבבים עם WT gDNA (ולהיפך), יכול לנבוע מהגברת צלב או הדימרים פריימר. ואכן, הדימרים פריימר הם לעתים קרובות גלויים על ידי ג'ל אלקטרופורזה (איור 1) ומהווים מקור סביר של טעות. ליישום של qPCR, הבדיקה של עקומות להמיס יכולה להיות שימושית כדי לקבוע אם מינים שונים, כגון הדימרים פריימר, עשויים לתרום לאות. יתר על כן, Performing ניסוי שליטה בי פריימרים מנופקים בהעדר תבנית ה- DNA עשוי לסייע בזיהוי פריימרים עם נטייה לdimerize. הגברה צלב ניתן להבחין על ידי ג'ל אלקטרופורזה, בפרט אם מחזורי PCR יותר מדי מבוצעים או אם טמפרטורת חישול נמוכה מדי. יש לנו ניסיתי לצמצם את מספר התוצאות החיוביות שגויות בגלל ההגברה צלב על ידי אופטימיזציה של שני פרמטרים אלה לפרוטוקול qPCRTag. לבסוף, בוחן את ערכי נקודת מעבר (CP) לכל אחד גם יכול לסייע בזיהוי צבעי יסוד שאינם מתאימים לאיתור מבוסס זמן אמת (איור 3, למשל, Bb22, Fb22, Bb46, Fb46). בסך הכל בניסוי זה השיעור החיובי הכוזב היה נמוך לפריימרים SYN עם תבנית WT (~ 5%) וגבוה יותר לפריימרים WT עם תבנית SYN (~ 10%). איור 2: מפת חום פלייט בו מוצגות נוכחות / abשיחת היגיון לניסוי qPCRTag. ארבעה סוגים שונים של DNA גנומי (רביעים מופרדים על ידי קווים לבנים מוצקים) היו נתונים לניתוח PCRTag באמצעות סינטטי (SYN) וסוג בר כרומוזום 3 פריימרים PCRTag (WT) (קווים מקווקווים לבנים להפריד SYN (למעלה ) וWT (למטה) בכל רבע). WT וsynIXR gDNA לקודד כרומוזום מהסוג בר 3, מניב הגברה עם פריימרים WT PCRTag. SynIII וsynIII synIXR gDNA לקודד כרומוזום סינטטי 3, מניב הגברה עם פריימרים SYN PCRTag. Primers הם ערוכים בהתאם למיצוב כרומוזומליות מהשמאל לימין ואת מיקומו באופן זהה בארבעת רביעים להשוואה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: חום פלייטמפת מוצגות מעבר ערך (CP) לניסוי qPCRTag. זהה אותו בסיס הנתונים כמו באיור 2 ופריסת הצלחת לכן זהה. N / מתייחס ל'לא הגברה '. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

התאגדות של זיהוי PCR בזמן אמת לassay genotyping PCRTag היא התפתחות חשובה עבור פרויקט Sc2.0 שכן הוא מאפשר תפוקה גבוהה יותר באופן משמעותי. העבודה הקודמת שצוינה 2.5 תגובות μl ב384 צלחות גם PCR, זמן 1.5 שעות ריצת רכיבה תרמית, ג'ל אלקטרופורזה agarose, וביאור במדריך של ג'ל.

העבודה שהוצגה כאן, נקראת ניתוח qPCRTag, מתגברת על כמה צווארי בקבוק גדולים. ראשית, ריצת qPCRTag מתעבה 4 x 384 צלחות גם לניסוי יחיד שיכול להיות מעובד, כדי להתחיל לסיים (צלחת להגדיר בתוספת זמן ריצה), כבשעה. זה משמעותי לציין כי העלות מגיב לכל גם לניתוח qPCRTag היא באחידות עם הגישה מבוססת ג'ל הנמוך תפוקת agarose. עם זאת, על ידי עקיפת ג'ל אלקטרופורזה וביאור ספר, העבודה qPCRTag מאפשרת חיסכון משמעותי בזמן ובעבודה, המהווים את היתרונות הגדולים. חשוב לציין את העבודה qPCRTag היא entirely תואם עם אוטומציה.

חשש עיקרי בשימוש בזיהוי בזמן אמת כפלט של assay PCRTag הוא השיעור של תוצאות חיוביות שגויות ותשלילי שווא. מאז פריימרים PCRTag לא נועדו במקור לשימוש בזמן אמת PCR, צפוי כי לא כל זוגות פריימר יהיו מתאימים לשימוש עם פלט זה. לשם כך חשוב לאמת את הפונקציה וספציפיות של כל זוגות פריימר PCRTag להוציא משנה שלא עובד בassay מבוסס זמן אמת מלפנים. לדוגמא, תוצאות חיוביות שגויות כרומוזום 3 PCRTag ותשלילים הם על ידי-ו-גדול לשחזור בזמן אמת נתונים PCR (איורים 2 ו -3) וניתן לשלול אלה מניתוח נוסף. יתר על כן, זוגות פריימר הידועים להיכשל (הוערך על ידי ג'ל אלקטרופורזה ומוצגים בS6 דמויות וS7 של Annaluru et al. ¹⁾ יכול גם להיות שלילי. מטרה זו מושגת בקלות פשוט excluדינג זוגות פריימר הפגומים בעת הגדרת פרוטוקול ההעברה אקוסטית.

כמו רוב מבחני תפוקה גבוהה, בכוונתנו להשתמש בזיהוי PCRTag זמן אמת כמסך עיקרי לזהות transformants שיזכה אימות נוספת במורד הזרם. בהמשך לכך, תקן הזהב להקרנה משנית יישאר ניתוח PCRTag עם ג'ל אלקטרופורזה כקריאת הנתונים. מעבר ליישום של ניתוח PCRTag לSc2.0, שילוב מערכות טיפול נוזל ננו המדינה של האמנות עם טכנולוגית ה- PCR בזמן אמת תפוקה גבוהה מאפשר ניתוח מהיר ואוטומטי ויש לו פוטנציאל להשפיע בתחומים רבים. לדוגמא, זרימת עבודה זו יכולה להיות מיושמת על הקרנת תפוקה גבוהה ספרייה, אבחון מחלות זיהומיות, ניתוח Microbiome, ועריכת הגנום חדשני גישות מנסה לשנות לוקוסים מרובים בו זמנית.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע גרנט MCB-0718846 וביטחון לפרויקטי מחקר מתקדם סוכנות חוזה N66001-12-C-4020 (לJDB). לאם מומנה על ידי מענק דוקטורט ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה. פרסומו של מאמר זה הוא בחסות רוש.

Materials

			Yeast gDNA prep
yeast gDNA	custom	custom	template for real time PCR
Acid-washed glass beads (0.5mm)	Sigma	G8772	yeast cell lysis
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)	Invitrogen	15593-031	yeast cell lysis
5432 Mixer	Eppendorf	5432	yeast cell lysis
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	22621807	yeast cell lysis
Qubit 3.0 Fluorometer	Life Technologies	Q33216	gDNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Life Technologies	Q32850	gDNA quantification
Labcyte 384PP plate	Labcyte	P-05525	gDNA source plate

			DNA Green Mastermix prep and dispensing
LightCycler 1536 DNA Green	Roche	5573092001	real time PCR mastermix
1.5mL Microfuge Tube Holder	ARI	EST BD060314-1	microfuge tube holder for deck of Cobra
LightCycler 1536 Multiwell Plate	Roche	5358639001
Cobra liquid handling system	Art Robbins Instruments	630-1000-10	dispense qPCR master mix into 1536 plate
PCR Plate Spinner	VWR	89184-608	cenrifugation of 1536 plate

			Template and primer dispensing
PCRTag primers	IDT	custom	premixed forward and reverse, [50uM] each
TempPlate pierceable sealing foil, sterile	USA Scientific	2923-0110	temporary seal for PCRTag primer plates
Labcyte LDV 384 well plate	Labcyte	LP-0200	pre-mixed primer source plate
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte		transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate
Plateloc Thermal Microplate Sealer	Agilent	G5402-90001	heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run
Clear Permanent Seal	Agilent	24212-001	optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage	Agilent	G5402-20008	can substitute ~2mm thick washers
Sorvall Legend XTR	Thermo Scientfic	75-004-521	centrifuge heat sealed 1536 plate
Industrial Air Compressor	Jun Air	1795011	to run the Echo and Heat Sealer

			Real Time PCR
LightCycler 1536	Roche		requires 220V outlet

References

Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344 (6179), 55-58 (2014).
Dymond, J. S., et al. Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design. Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).
Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-547 (1996).
Dymond, J., Boeke, J. The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization. Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).
Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).
Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. Design-A-Gene with GeneDesign. Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).
Lajoie, M. J., et al. Probing the limits of genetic recoding in essential genes. Science. 342 (6156), 361-363 (2013).
Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast. Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).
Dymond, J. S. Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).
Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Mitchell, L. A., Phillips, N. A., Lafont, A., Martin, J. A., Cutting, R., Boeke, J. D. qPCRTag Analysis – A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping. J. Vis. Exp. (99), e52941, doi:10.3791/52941 (2015).