Легким и эффективным Подготовка Tri-компонентов флуоресцентных гликополимеров помощью плот контролируется полимеризации
Summary
An efficient, three-step synthesis of RAFT-based fluorescent glycopolymers, consisting of glycomonomer preparation, copolymerization, and post-modification, is demonstrated. This protocol can be used to prepare RAFT-based statistical glycopolymers with desired structures.
Abstract
Синтетические гликополимеров инструментальные и универсальные инструменты, используемые в различных биохимических и биомедицинских исследований полей. Пример легким и эффективным синтеза хорошо контролируемых флуоресцентные статистических гликополимеров с использованием обратимого присоединения-фрагментации переноса цепи (RAFT) основе полимеризации продемонстрирована. Синтез начинается с подготовки β-галактозы содержащие glycomonomer 2-lactobionamidoethyl метакриламида полученной реакцией lactobionolactone и N – (2-аминоэтил) метакриламида (AEMA). 2-Gluconamidoethyl метакриламид (GAEMA) используется в качестве структурного аналога хватает терминала β-галактозид. Ниже РАФТ-опосредованной реакции сополимеризации включает три различных мономеров: N – (2-гидроксиэтил) акриламид в качестве спейсера, AEMA в качестве мишени дл дальнейшего маркировки флуоресценции, а glycomonomers. Устойчивость к воздействию водных системах, плота агент, используемый в реакции (4-cyanopentanoic кислота) -4-dithiobenzoate.Низкие дисперсности (≤1.32), предсказуемые композиции сополимера, и высокая воспроизводимость полимеризации наблюдается среди продукции. Люминесцентные полимеры получают путем модификации гликополимеров с карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловым эфира таргетирования первичный амин функциональные группы на AEMA. Лектин-связывающий особенности получаемых гликополимеров проверяются путем тестирования с соответствующими бисером агарозы, покрытых конкретных glycoepitope признания лектинов. Из-за легкости синтеза, жесткий контроль составы продуктов и хорошую воспроизводимость реакции, этот протокол может быть переведен в направлении получения других плота на основе гликополимеров с конкретным структурам и композициям, как хотелось бы.
Introduction
В последние два десятилетия, исследования с синтетическими гликополимеров прошли медленный, но постоянное развитие, демонстрируя значительный потенциал в изучении инфекционных механизмы, которые включают исследования, которая фокусируется на лектин признание процессов 1-3. Так синтетические гликополимеров обладающие мультивалентные сахара фрагменты демонстрируют гораздо более высокие лектин-связывающий эффективностями, по сравнению с одновалентных углеводов, они пользуются большим спросом в области Glycobiology 3. Особый интерес в области клинических исследований является использование флуоресцентных гликополимеров охарактеризовать лектин-опосредованного связывания бактериальных с углеводами, доступных на поверхностях человека дыхательных клеток и слизистой гликопротеина. В начале пробирке исследования использованы коммерчески доступные на основе полиакриламида гликополимеров в бактериальных обязательных тестов. Некоторые из этих зондов показали многообещающие результаты, но выразили обеспокоенность относительно, obtainability и много-много-к дисперсий в обоих PolYmer молекулярная масса и содержание glycoepitope. Экономичный протокол в лаборатории-был разработан, который будет обеспечивать для удовлетворительного контроля содержания структуры, размера и чистоты синтетических гликополимеров ориентированных бактериальных лектинов.
В поисках подходящего синтетического подхода к гликополимеров, относительно новый метод полимеризации был протестирован с использованием типа контролируемой радикальной полимеризации, что используемый обратимым дополнение фрагментации цепи передачи (плот) агентов 4. Такие реагенты RAFT недавно были использованы в нескольких glycopolymer препаратов 5-7. По сравнению с другими протоколами подготовки glycopolymer, плот опосредованной полимеризации демонстрируют несколько преимуществ, в том числе устойчивостью к различным мономерных структур и условий реакции, потенциальной совместимости с водными растворами, и маленький размер дисперсности желаемых полимерных продуктов 8,9. Из заметных интересных протоколы для подготовки плот баSED Tri-компонент гликополимеров, что позволяет контролировать композиций различных мономеров, каждый из которых может иметь различные функции 10-13. Тем не менее, большинство из предыдущих исследовательских усилий либо не было аномерные боковые углеводы 10, или применяться вышел полимеризации в результате три-блок-сополимеров, которые состоят из ковалентно связанных гомополимеров, которые часто служат для разных целей, чем статистических полимеров, которые представляют собой сополимеры, в которых последовательность мономера остатки следовать статистической правило 9-13.
Недавно, применяя thiocarbonylthio RAFT соединение (4-cyanopentanoic кислота) -4-dithiobenzoate в водной среде, подготовка группы плота на основе линейных три–компонент статистические гликополимеров содержащие специфические боковые сахаров и их применение в лектин-опосредованного связывания бактериальной Тесты сообщалось 14. Общая цель этого способа, представленного в визуальной форме, чтобы подготовить три-компонентстатистические люминесцентные гликополимеров через плот контролируемой сополимеризации. Из-за простоты протокола полимеризации одностадийного, в порядке контроля по длине полимерной композиции и, и высокой воспроизводимости реакции, этот протокол может быть легко применены к другим плот на основе синтеза гликополимеров с заданными структурами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Легкий и эффективный протокол для плот основе три- компонент люминесцентных гликополимеров, с и без подвесного углеводов, и их использование в тесте лектин-связывания, будет показано в этом докладе. Протокол начинается с подготовки glycomonomers LAEMA и GAEMA. Через одностадийном плот контролируется сополимеризации, гликополимеров с воспроизводимым выходом, предсказуемой состава мономера и низкой дисперсности, получаются. После пост-модификации гликополимеров карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфира, связывание полученной соответствующего флуоресцентного меченных glycopolymer легко проверяемым своей лектина специфичность связывания.
На начальных препаративных ступеньках glycomonomers, которые должны быть использованы в последующих синтезах glycopolymer, легко доступны лактобионовая кислота и глюконолактон были использованы. В теории, любые углеводы, представляющие интерес, из моносахаридов до сложных олигосахаридов, может быть Converted чтобы glycomonomers путем конъюгирования целевой сахара на первичной гидроксильной группы на С6 глюкозы. После окисления восстановительного остатка глюкозы, и ее последующей дегидратацией до лактона, продукт может затем быть легко взаимодействует с первичным амином в AEMA с образованием соответствующего glycomonomer. Дальнейшие примеры этому маршруту можно увидеть в недавнем докладе 14. Следует отметить, что до начала любой стадии полимеризации, МеГХ, мощным ингибитором полимеризации, должен быть удален из всех мономерных и glycomonomer препаратов непосредственно перед использованием. Это легко достигается с помощью минимального количества метанола, чтобы растворить glycomonomer который обладает МеГХ затем сразу обработать его с ацетоном при температуре -20 ° С для осаждения ингибитора свободных продукт с высоким выходом.
Эфирное в какой-либо радикальной полимеризации схеме, внимание к деталям и чистоты мономера подчеркнул. Как это типично системы РАФТ полимеризации, состоит израдикальная источник, РАФТ реагент, мономер и растворитель. В этом визуализируется представления, система РАФТ полимеризации одного шага описано, что основное внимание на производство статистических сополимеров, полученных из реакционной смеси, обладающей три различных мономеров в водном растворе. Два отдельных плот опосредованной реакции представлены в которой один использует glycomonomer, обладающий кулон, невосстанавливающих углеводов конце (т.е. β-D-галактозы), а другой, обладающий полиола не связанного углеводного остатка. Общим для обоих плота-опосредованной реакции мономеры, имеющие особую гидроксильную группу, которая служит в качестве спейсера молекулу, а другой, обладающий свободного амина для пост-модификации с флуорофором амино-реактивного.
Так присутствии кислорода в реакционной смеси и наносит ущерб окружающей среде сплавляться-опосредованной полимеризации, его удаление проследить уровни легко осуществляется с помощью нескольких сублимационной Evaциклов cuate-оттаивания при сохранении реакционную трубку Шленка сосуд под высоким вакуумом.
Следует отметить, что молярное соотношение различных мономеров в реакции можно регулировать, как это необходимо. Кроме того, путем изменения количества плота агента, длина получаемых полимеров можно контролировать 18. Тем не менее, молярное отношение плота агента инициатора всегда должно быть больше, чем два, чтобы обеспечить низкую дисперсность продукта. В этих условиях, эволюция сополимеризации устойчива и воспроизводимость реакции очень высока. Это, как говорится, маловероятно, что один получает совершенно равномерное распределение всех участвующих мономеров в пределах статистической сополимера, из-за их разной скоростью полимеризации. Характеризующие распределение различных мономеров в полимерной еще очень сложным.
Метод пост-модификация, представленная здесь, и проще, и amenablе с использованием более широкого выбора флуоресцентных меток, по сравнению с другими протоколами, применяемых к этикетке гликополимеров 2,11. Они будут включать в себя многие из водорастворимых аминов-реактивного флуорофорами, квантовые точки, биотинами и другие. Связывания особенности синтезированных меченых, гликополимеров легко проверяемые с помощью лектинов с известными аффинности связывания. PMA-GAEMA, владевших не кулон сахар является подходящим отрицательный контроль. Гликополимеров с различными флуоресцентными метками, подготовленных по этому маршруту были успешно использованы в исследованиях лектин-опосредованного связывания бактериального 14. Как представлено, это легким и эффективным подготовка статистических флуоресцентных гликополимеров должен обеспечивать большой потенциал для широкого круга исследований glycobiological.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Experiment Station Chemical Laboratories of the University of Missouri, and by the Cystic Fibrosis Association of Missouri.
Materials
| Reagent | |||
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| D-Gluconolactone | Sigma-Aldrich | G2164 | |
| N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| Orange II sodium salt | Sigma-Aldrich | O8126 | |
| Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) | Sigma-Aldrich | 54050 | Polymerization inhibitor |
| N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) | Polysciences, Inc | 24833-5 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | BP-616 | |
| Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh | Sigma-Aldrich | 10343-U | |
| Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh | Sigma-Aldrich | 217514 | |
| Aluminum oxide, ~150 mesh | Sigma-Aldrich | A1522 | Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I |
| Ninhydrin | Sigma-Aldrich | N4876 | An ethanol solution of 0.2 % ninhydrin was used in the test |
| 4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid | Sigma-Aldrich | 722995 | RAFT agent |
| 4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) | Sigma-Aldrich | 11588 | Polymerization initiator |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester | Life Technologies | C1157 | |
| Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead | Vector Laboratorie | AL-1143 | |
| Solvent | |||
| dH2O | Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | A461-4 | ACS grade or better |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | ACS grade or better |
| Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | ACS grade or better |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 22705 | ACS grade or better |
| Acetone | Fisher Scientific | A929-4 | ACS grade or better |
| Equipment | |||
| Dialysis membrane (MWCO: 3,500) | Spectrum Labs | 132720 | |
| Polyethylene glycol analytical standard standard | Sigma-Aldrich | O2393 | |
| Schlenk tube, 1 mL | Quark Glass | Customized | |
| TSK-GEL G4000 PWxl | Tosoh Bioscience | 8022 | Used for GPC analysis of the glycopolymers |
| Empower 3 with GPC/SEC package | Waters Corporation | ||
| Waters Alliance HPLC system | Waters Corporation | Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475) | |
| Avance III 800 MHz NMR Spectrometer | Brucker Corporation | ||
| BX43 fluorescence microscope | Olympus Corporation | Used with FITC filter in the glycopolymer binding test | |
| Rotavap / Rotoevaporator | Heidolph | ||
| Fritted disc funnel | Fisher Scientific | 10-310-109 | |
| Lyophilizer | Labconco | ||
| Immunofluorescence microscope slide | Polysciences | 18357-1 | |
| Revco Ultima Plus -80C Freezer | Thermo Scientific | ||
| Plastic Vacuum Bag and Hand Pump | Ziploc | ||
| Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus | Fisher Scientific | ||
| Vacuum Gauge | Sargent-Welch | ||
References
- Scharfman, A., et al. Pseudomonas aeruginosa binds to neoglycoconjugates bearing mucin carbohydrate determinants and predominantly to sialyl-Lewis x conjugates. Glycobiology. 9 (8), 757-764 (1999).
- Song, E. H., et al. In vivo targeting of alveolar macrophages via RAFT-based glycopolymers. Biomaterials. 33 (28), 6889-6897 (2012).
- Wolfenden, M. L., Cloninger, M. J., Wang, B., Boons, G. .. -. J. Chapter 14. Multivalency in carbohydrate binding. Carbohydrate Recognition: Biological Problems, Methods, and Applications. , 349-370 (2011).
- Moad, G., Rizzardo, E., Thang, S. H. Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis. Polymer. 49 (5), 1079-1131 (2007).
- Spain, S. G., Gibson, M. I., Cameron, N. R. Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 45 (11), 2059-2072 (2007).
- Bernard, J., Hao, X., Davis, T. P., Barner-Kowollik, C., Stenzel, M. H. Synthesis of various glycopolymer architectures via RAFT polymerization: From block copolymers to stars. Biomacromolecules. 7 (1), 232-238 (2006).
- Bulmus, V. RAFT polymerization mediated bioconjugation strategies. Polym. Chem. 2, 1463-1472 (2011).
- Ting, S. R. S., Chen, G., Stenzel, M. H. Synthesis of glycopolymers and their multivalent recognitions with lectins. Polymer Chemistry. 1, 1392-1412 (2010).
- Vazquez-Dorbatt, V., Lee, J., Lin, E. W., Maynard, H. D. Synthesis of glycopolymers by controlled radical polymerization techniques and their applications. Chembiochem. 13, 2478-2487 (2012).
- Jiang, X., Ahmed, M., Deng, Z., Narain, R. Biotinylated glyco-functionalized quantum dots: Synthesis, characterization, and cytotoxicity studies. Bioconjugate Chem. 20 (5), 994-1001 (2009).
- Deng, Z., Li, S., Jiang, X., Narain, R. Well-defined galactose-containing multi-functional copolymers and glyconanoparticles for biomolecular recognition processes. Macromolecules. 42 (17), 6393-6405 (2009).
- Qin, Z., et al. Galactosylated N-2-hydroxypropyl methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl methacrylamide block copolymers as hepatocyte-targeting gene carriers. Bioconjugate Chem. 22 (8), 1503-1512 (2011).
- Albertin, L., Wolnik, A., Ghadban, A., Dubreuil, F. Aqueous RAFT polymerization of N-acryloylmorpholine, synthesis of an ABA triblock glycopolymer and study of its self-association behavior. Macromol. Chem. Phys. 213 (17), 1768-1782 (2012).
- Wang, W., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. RAFT-based tri-component fluorescent glycopolymers: synthesis, characterization and application in lectin-mediated bacterial binding study. Glycoconj. J. 31 (2), 133-143 (2014).
- Deng, Z., Ahmed, M., Narain, R. Novel well-defined glycopolymers synthesized via the reversible addition fragmentation chain transfer process in aqueous media. J. Polymer Sci. Part A: Polym. Chem. 47 (2), 614-627 (2009).
- Noel, S., Liberelle, B., Robitaille, L., De Crescenzo, G. Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces. Bioconjugate Chem. 22 (8), 1690-1699 (2011).
- Fox, A., Morgan, S. L., Gilbart, J., Biermann, C. J., McGinnis, G. D. Preparation of alditol acetates and their analysis by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). Analysis of Carbohydrates by GLC and MS. , 87-170 (1989).
- Thomas, D. B., et al. Kinetics and molecular weight control of the polymerization of acrylamide via RAFT. Macromolecules. 37 (24), 8941-8950 (2004).
