RAFT 중합 제어를 통해 트라이 구성 요소 형광 Glycopolymers의 손쉬운 및 효율적인 준비

Glycomonomer 1. 합성 2 Lactobionamidoethyl 메타 크릴 이 솔루션은 단지 흐린 될 때까지 한 방울 현명한 방식으로 무수 에탄올을 추가 천천히 무수 메탄올 3.0 ㎖에 락토 산 2g을 용해하고, 다음 rotoevaporation를 통해 용매를 제거합니다. 3.0 ml의 무수 메탄올과 다시 한번 천천히 다음, 그냥 흐린까지 무수 에탄올을 추가 rotoevaporation를 통해 용매를 증발 단계 1.1에서, 잔류 물을 용해. lactobiono -1,5- 락톤 (1.94 g, 수율 98 %)을 획득하기 위해이 공정을 3 회 반복한다. 이 제품은 다음 반응에 사용하기에 충분한 순도이다. N의 메탄올 3.0 ㎖에 lactobionolactone 1.0 g을 추가 – (2- 아미노 에틸) 메타 크릴 아미드 (AEMA, 0.58 g) 및 히드로퀴논 모노 메틸 에테르 (MEHQ, 1.0 ㎎)을, 자기 중합 억제제, 2.0 ml의 메탄올이 따랐다 트리 에틸 아민 1.0 ml로. 48 시간 동안 RT에서 교반 하였다. 탈 H 2 O 20 ㎖ (DH 2 추가 </서브 반응 플라스크에> O), 다음 rotoevaporation를 통해 증발 건조하여 메탄올과 무료 트리 에틸 아민을 제거합니다. MEHQ 1.0 ㎎을 함유 수신을 비커에 넣고, – (형태, 10mm X 20mm OH) DH 2 O 20㎖를 다음 음이온 교환 컬럼을 통해 수용액을 통과 추가 나머지 락토 산을 제거한다. rotoevaporation를 통해 건조 될 때까지 증발시켜, 단계 1.5에서 생산되는 트리 에틸 아민을 제거합니다. DH 2 O의 20 ML을 추가하고 천천히 반응 물질이 검출되어 더 닌히 드린까지 양이온 교환 수지 (H + 형태)의 1 mg의 분취 량을 추가하여 미 반응 AEMA를 제거합니다. 에탄올 용액에 2 % 닌히 드린과 플레이트 살포 박층 크로마토 판에 적용, 각 첨가 후 수지 액 1 ㎕를 분취 액을 취함으로써 제거를 모니터한다. 더 깊은 청색 판은 1 분 동안 90 ° C까지 가열 할 때에 개발이 관찰되지 않은 경우, 종료점에 도달했다. <l난> 동결 건조 후, 시험관 여액을 전송, 프릿 유리 깔때기를 통해 용액을 여과 -80 ° C에서 샘플을 동결하고. 냉간 무수 아세톤을 추가의 메탄올 (~ 0.5 ㎖)의 최소량 동결 건조 물질을 용해시킴으로써 샘플로부터 제거 MEHQ (-20 C, 15 mL의 °) 생성물을 침전. 다음 회백색 분말 (0.94 g, 수율 68 %) 2- lactobionamidoethyl 메타 크릴 아미드 (LAEMA)을 얻었다 진공하에 데시 케이 터 내에서 침전물을 건조, 프릿 유리 깔대기를 사용하여 여과에 의해 침전물을 수집. 이 제품은 다음 반응에 사용하기에 충분한 순도이다. 모노머의 합성 2. 2 Gluconamidoethyl 메타 크릴 참고 : 펜던트 설탕을 소유하지 않는 2 gluconamidoethyl의 메타 크릴 아미드의 제조 (개마)는, 게시 방법 (15)에서 적응했다. 용액에 메탄올 10 ㎖에 용해 AEMA 2.0 g 추가교반하면서 메탄올 30 ㎖에 D-글루 코노 락톤 (1.6 g) 및,의, 천천히 트리 에틸 아민 1.6 ml를 추가합니다. 24 시간 동안 실온에서 반응을 저어. 건조 후, 아세톤 10 mL로 세척, 프릿 유리 깔대기를 사용하여 침전 된 생성물을 여과하고 침전물을 이소프로판올 10 mL 씩 3 회 헹군다. 진공 데시 케이 터에 침전 된 제품을 건조시킵니다. 3. R​​AFT Glycopolymer 합성 상업적 N에 존재 MEHQ 억제제 제거 – (2- 히드 록시 에틸) 아크릴 아미드 (HEAA)을 산화 알루미늄 나노 입자 0.5 g을 첨가 한 다음 2 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 1 ㎖ HEAA를 추가한다. 30 초 동안 300 XG에서 튜브를 원심 분리기 및 다음 반응에 상부층 HEAA를 사용한다. 조심스럽게 LAEMA의 32.8 mg의 (70.0 μmol), AEMA 1.7 mg의 (10.5 μmol)과 HEAA (270 μmol)의 27.5 μl를 추가, 모든 따라서, 잘 정리 1 ml의 쉬 렌크 튜브에, DH 2 O의 0.4 ㎖에 녹이고 monom을 가진3 : 77 (20)의 어 몰비. 병렬 반응에서, 단계 3.2 LAEMA를 사용하는 대신 어느 펜던트 설탕을 소유하지 않는 제어 중합체를 생성 반응에서 개마 21.4 mg의 (70.0 μmol)를 대체하기 위해. 각각의 슈 렝크 튜브 (즉, 3.2 또는 3.3)에 순차적으로 DMF 중 250 μg의 함유 (4- 시아 노펜 산 벤질) 디티 오 벤조 에이트 (1.9 μmol, RAFT 제) 0.53 ㎎, 및 DMF의 50 μl를 함유 한 50 μL를 추가 4,4'- 아조 비스 (4- 시아 노 발레르 산) (0.9 μmol, 개시제). 부드럽게 손가락을 눌러 섞는다. 쉬 렌크 관에 함유 내용 드라이 아이스를 이용한 동결 : 에탄올 욕 (100 ㎖ 에탄올 75g 드라이 아이스), 10 ~ 50 mTorr의 내부에 진공을 적용하고 슈렌 밸브를 닫고 실온까지 서서히 해동 용액을 허용 . 두 번 더이 동결 피난 – 해동 사이클을 반복합니다. 모든 시약은 지난 해동 후 용해되어 있는지 확인합니다. 밀봉 플라스틱 바로 쉬 렌크 튜브를 배치g는 백 탈기 한 다음 밀봉. 70 ° C로 예열 수욕으로 슐 렌크 튜브를 함유하는 백을 전송하고 24 시간 동안 배양한다. 조심스럽게 준비된 투석 백 (= 3,500 MWCO)에 쉬 렌크 관에서 솔루션을 전송하고, 처음 8 시간 동안 DH 2 O 매 시간마다 변경, 24 시간 동안 DH 2 O (10 × 2 L)에 대해 투석. 투석 후, 시험관 투석 튜브에서 샘플을 전송 -80 ° C에서 샘플을 동결 한 다음 동결 건조. 주 : 얻어진 통계 폴리 메타 크릴 아미드 / 아크릴 아미드 (PMA) 펜던트를하거나 (단계 3.3) D-글루 콘 (단계 3.2) -4- O의 -β-D-갈 락토-D-글루 콘 (lactobionamide)를 함유하는 공중 합체는 각각 아르 획득. 논의의 편의를 위해,이 두 glycopolymers 각각 PMA-LAEMA 및 PMA-개마로 축약된다. 형광 발색단과 Glycopolymers 4. 수정 후 </P> 각각 인산 완충 식염수 (PBS, 0.1 M 나트륨 포스페이트, 0.15 M 염화나트륨, pH를 7.5) 0.9 ㎖에 차 아민 관능기 ~ 0.9 μmole 함유 glycopolymer PMA-LAEMA 또는 PMA-개마 5.0 ㎎을 녹인다. 천천히 빠른 교반 솔루션 DMF 100 ㎕에 카르복시 숙신 이미 딜 에스테르의 0.6 mg을 추가합니다. 부드럽게 실온에서 어둠 속에서 16 시간 동안 반응을 저어. 빛으로부터 보호하면서, 제조 투석 튜빙 (MWCO = 3,500)에 샘플을 로딩하고 상기 제 8 시간 동안 투석액 매시간 변화 16 시간 동안 DH 2 O (2 L)에 대해 투석. 투석 후, 시험관 투석 튜브에서 샘플을 전송 -80 ° C에서 샘플을 동결 한 다음 동결 건조. 참고 : 동결 건조 후, 형광 glycopolymers PMA-LAEMA – 플루 오레와 PMA-개마 – 플루 오레는 각각 얻을 수있다. 의 Gly 5. 특성공중 합체 수 평균 분자량 (Mn), 중량 평균 분자량 (M w) 및 겔 투과 크로마토 그래피 (GPC) 소프트웨어, GPC 구비 상업적 HPLC 시스템 glycopolymers의 분산도 (M w / M n을)를 결정 0.6 ㎖ / 분 (14)의 유속으로 용 리제로서 0.1 M 트리스 / 0.1 M 염화나트륨 완충액 (pH 7)를 사용하여 관심의 분자량 및 굴절률 검출기, 적합한 열. (: 200-1,200,000 g / 몰 MW) 기준 분자량 폴리에틸렌 글리콜 표준을 사용한다. glycopolymers (16) 내에서 주 아민 작용기의 실제 농도를 정량화. 게시 된 방법 (17)에 따라 합성 glycopolymers의 총 탄수화물 함량을 분석 할 수 있습니다. , 개마 및 glycopolymers PMA-LAEMA, PMA-개마는 NMR 분광법 (14)에 의해 D 2 O에 구조 조성 및 glycomonomers의 LAEMA의 순도 시험을 수행. 와 합성 Glycopolymers 6. 바인딩 테스트 아가로 오스 비즈 렉틴은 코팅 1 분 300 XG에하는 Erythrina crista – 갈리 렉틴 (ECL) 코팅 된 아가로 오스 비즈 정지, 원심 분리기의 50 μL에 PBS 1.5 mL를 넣고 조심스럽게 제거하고 뜨는 폐기하십시오. 두 번이 단계를 반복 한 다음 PBS 0.5 ㎖에 구슬을 재현 탁. 1 시간 동안 실온에서, 어둠 속에서, 추가 3 PMA-LAEMA – 형광 또는 구슬 서스펜션에 PBS의 6 μL에서 PMA-개마 – 형광 (대조군)의 μg의, 및 이들의 혼합물을 품어. PBS 0.2 ml의 PBS로 세 번에 resuspend 구슬의 1.5 ml의 혼합물을 씻으십시오. (여기 파장을, (테프론 코팅 된) 면역 형광 현미경 슬라이드에 잘로 분취 량 (4 μL)을로드 커버 슬립으로 덮고, 및 FITC 필터를 사용하여 형광 현미경으로 관찰 : 467-498 nm의 발광 파장을 : 513-을 566 ㎚) 및 10X 대물 렌즈는 t의 결합을 검사그는 구슬 (14) glycopolymers 형광등.