通过RAFT控制聚合轻便和高效制备三组分荧光Glycopolymers

1.合成Glycomonomer 2- Lactobionamidoethyl甲基丙烯酰胺溶解2克乳糖酸3.0毫升无水甲醇和缓慢下降明智的时尚加无水乙醇直到溶液刚变浑浊，然后通过旋转蒸发除去溶剂。 溶解残渣，从步骤1.1，溶在3.0ml无水甲醇中，并再次，慢慢加入无水乙醇直至刚好混浊，然后经由旋转蒸发蒸去溶剂。重复此步骤3次，得到lactobiono -1,5-内酯（1.94克，98％产率）。此产品具有足够的纯度在下面反应中使用。 3.0毫升甲醇中添加1.0克lactobionolactone与N – （2-氨基乙基）甲基丙烯酰胺（AEMA，0.58克）和氢醌单甲醚（MEHQ，1.0毫克），自聚合的抑制剂，2.0毫升甲醇中，接着以1.0毫升三乙胺。在RT搅拌48小时。 加20 500ml的去离子H 2澳（DH 2 </子> O）的反应烧瓶中，然后通过蒸发除去甲醇和自由三乙胺通过旋转蒸发浓缩至干。 以除去任何剩余的乳糖酸，加20的dh 2 O中的溶液，然后通过阴离子交换柱的水溶液（OH -型 ，10毫米×20毫米）到含有1.0毫克的MEHQ接收烧杯中。 除去三乙胺，在步骤1.5中产生的，通过蒸发，通过旋转蒸发浓缩至干。 添加20毫升的dh 2 O，并通过缓慢加入阳离子交换树脂（H +型 ）的1毫克等分试样直至不再茚三酮反应性材料是可检测的除去未反应AEMA。监视除去通过取该溶液的1微升等份各树脂加入后，将其应用到一个薄层层析板，然后喷涂板在乙醇溶液中的2％茚三酮。当没有深蓝色的颜色被观察到的开发时，板被加热到90℃保持1分钟，终点已经到达。 <lI>通过多孔玻璃漏斗过滤溶液，将滤液转移到一个试管中，冷冻的样品在-80℃下，然后冷冻干燥。 从样品中取出的MEHQ通过在甲醇（约0.5毫升）的最低量溶解的冷冻干燥物，然后添加冷的无水丙酮（-20℃，15毫升）以沉淀产物。用烧结玻璃漏斗收集沉淀，通过过滤，然后干燥该沉淀物在干燥器中在真空下，得到2- lactobionamidoethyl甲基丙烯酰胺（LAEMA），为灰白色粉末（0.94克，68％产率）。此产品具有足够的纯度在下面反应中使用。 2.合成单体2- Gluconamidoethyl甲基丙烯酰胺注：2-gluconamidoethyl甲基的制备（GAEMA），它不具有侧链的糖，改编自发布方法15。 添加2.0克AEMA的溶解在10毫升甲醇中的溶液的D-葡萄糖酸内酯（1.6克）在30毫升甲醇中，并在搅拌下，慢慢地添加1.6毫升三乙胺。 在RT搅拌24小时，进行反应。 用烧结玻璃漏斗过滤沉淀出的产品，并冲洗沉淀三次，每次10毫升异丙醇中，然后用10毫升无水丙酮。干燥在真空下干燥器沉淀的产物。 3. R​​AFT Glycopolymer合成以除去抑制剂的MEHQ存在于商业的N – （2-羟基乙基）丙烯酰胺（HEAA），加入1 ml HEAA至2ml微量离心管中，随后加入0.5克三氧化二铝纳米颗粒。离心管中，在300×g离心30秒，并使用顶层HEAA在以下的反应。 小心加入32.8毫克LAEMA的（70.0微摩尔），1.7毫克AEMA的（10.5微摩尔）和27.5微升HEAA（270微摩尔），全部溶解在0.4的dh 2 O毫升，以良好的清洁1毫升Schlenk管，从而有一个monom3：77 20 ER摩尔比。 在平行的反应中，为了产生对照聚合物，其不具有任何挂件糖，以代替在步骤3.2采用LAEMA的，在反应代替21.4毫克GAEMA的（70.0微摩尔）。 到相应的Schlenk管（ 即 3.2或3.3），依次添加含0.53毫克（4-氰基戊酸）-4-二硫代苯甲酸酯（1.9微摩尔，RAFT试剂）和50微升DMF中含有250微克的DMF中的50微升4,4'-偶氮双（4-氰基戊酸）（0.9微摩尔，引发剂）。通过手指轻轻拍打混合。 冻结包含在Schlenk管内容采用干冰：乙醇浴（75克干冰在100ml乙醇中），内10-50毫乇施加真空，然后关闭的Schlenk阀并允许溶液缓慢解冻至室温。重复此冷冻撤离冻融循环两次。确保所有的试剂，最后解冻后解散。 将舒伦克管插入密封塑料BA克，疏散袋的空气，然后密封。含有Schlenk管袋转移到水浴预热在70℃孵育24小时。 在Schlenk管中的溶液小心地转移到准备好的透析袋（MWCO = 3500），和透析针对卫生署2 O（10×2升）24小时，改变的dh 2 O每隔一小时的前8个小时。以下透析，从透析管转移样品到一试管中，冷冻的样品在-80℃下，然后冻干它。 注意：得到的统计的聚甲基丙烯酰胺/丙烯酰胺（PMA）含有侧链4-ö-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡糖酰胺（lactobionamide）（来自步骤3.2）或D-葡糖酰胺（来自步骤3.3）共聚物，分别是获得。为便于讨论，这两个glycopolymers简写为PMA-LAEMA和PMA-GAEMA分别。 4.后期修饰Glycopolymers与荧光团</P> 溶解5.0毫克含有〜0.9微摩尔的伯胺官能团的glycopolymer PMA-LAEMA或PMA-GAEMA在0.9磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.1M磷酸钠，0.15M氯化钠，pH值7.5）中的溶液，分别慢慢在100μlDMF中添加0.6毫克的羧基琥珀酰亚胺基酯向快速搅拌下的解决方案。轻轻搅拌该反应16小时，在黑暗中在室温。 虽然避光，装载样品放入事先准备好的透析管（MWCO = 3500），并针对透析卫生署2 O（2升）16小时，更换透析液每隔一小时前8小时。以下透析，从透析管转移样品到一试管中，冷冻的样品在-80℃下，然后冻干它。 注意：按照冻干，荧光glycopolymers PMA-LAEMA荧光素和PMA-GAEMA荧光素，分别被获得。 在甘氨酸5表征共聚物确定数均分子量（M n）时，重均分子量（M w）的与glycopolymers的上装有凝胶渗透色谱法（GPC）的软件，其GPC商用HPLC系统的分散度（M W / M n）的列适合分子量的兴趣，和折射率检测器，用0.1M的Tris / 0.1M的氯化钠缓冲液（pH 7）作为洗脱剂以0.6ml / min的14的流速。使用聚乙二醇标准作为分子量标准（分子量：200-1,200,000克/摩尔）。 量化glycopolymers 16内伯胺官能团的实际浓度。根据公布的方法分析17总碳水化合物的含量合成glycopolymers的。 通过核磁共振光谱执行14结构组成和glycomonomers LAEMA纯度测试，GAEMA和glycopolymers PMA-LAEMA，PMA-GAEMA在D 2 O中。 合成Glycopolymers与6.结合凝集素试验涂琼脂糖珠添加1.5毫升PBS中至50μl悬浮液的鸡冠刺桐凝集素（ECL）包被的琼脂糖珠，离心机在300×g离心1分钟，并小心地取出和处理上清液。重复此步骤两次，然后重悬珠子在0.5ml PBS中。 加入3 PMA-LAEMA荧光素或PMA-GAEMA荧光素（阴性对照）在6微升PBS至珠粒悬浮微克，孵育混合物，在黑暗中，在室温进行1小时。 用1.5毫升PBS清洗3次，并重新悬浮珠0.2毫升的PBS洗涤混合物。加载一个等分试样（4微升）到一个井上的免疫荧光显微镜载玻片（聚四氟乙烯涂层），盖上盖玻片，并使用FITC滤波用荧光显微镜观察（激发波长：467-498纳米，发射波长：513- 566纳米）和10X客观的检查T的结合他荧光glycopolymers与珠14。