إعداد سطحي والفعال للGlycopolymers نيون ثلاثي مكون عبر تسيطر عليها RAFT البلمرة
Summary
An efficient, three-step synthesis of RAFT-based fluorescent glycopolymers, consisting of glycomonomer preparation, copolymerization, and post-modification, is demonstrated. This protocol can be used to prepare RAFT-based statistical glycopolymers with desired structures.
Abstract
glycopolymers الاصطناعية هي أدوات مفيدة وتنوعا المستخدمة في مختلف المجالات البحثية الحيوية والطبية الحيوية. مثال على تركيب سطحي وكفاءة glycopolymers الإحصائية الفلورسنت تسيطر عليها بشكل جيد باستخدام عكسها بالإضافة إلى ذلك، تجزئة سلسلة نقل ويتجلى (الطوافة) البلمرة المستندة. يبدأ تجميع مع إعداد المحتوية على β الجالاكتوز-glycomonomer 2-lactobionamidoethyl methacrylamide التي تم الحصول عليها عن طريق تفاعل lactobionolactone وN – (2-aminoethyl) methacrylamide (AEMA). يستخدم 2-Gluconamidoethyl methacrylamide (GAEMA) كما التناظرية الهيكلية التي تفتقر إلى محطة β-غالاكتوزيد. ينطوي على تفاعل البلمرة بوساطة RAFT الثلاثة التالية أحادية مختلفة: N – (2-هيدروكسي إيثيل) مادة الأكريلاميد كما الفاصل، AEMA هدفا لمزيد من العلامات مضان، وglycomonomers. تسامحا من النظم المائية، وكيل الطوافة المستخدمة في رد فعل هو (حمض 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate.وقد لوحظت dispersities منخفضة (≤1.32)، والتراكيب البوليمرات يمكن التنبؤ بها، واستنساخ عالية من polymerizations بين المنتجات. ويتم الحصول على البوليمرات الفلورية عن طريق تعديل glycopolymers مع استر carboxyfluorescein succinimidyl استهداف المجموعات الوظيفية أمين أساسي على AEMA. يتم التحقق من خصوصيات-كتين ملزمة للglycopolymers الناتجة عن طريق اختبار مع حبات الاغاروز المقابلة المغلفة مع glycoepitope الاعتراف يكتينس محددة. بسبب سهولة من التوليف، ورقابة مشددة من المؤلفات المنتج واستنساخ جيدة للتفاعل، وهذا البروتوكول يمكن ترجمتها نحو إعداد البعض glycopolymers القائم على الطوافة مع الهياكل والتراكيب محددة، كما تريد.
Introduction
في العقدين الماضيين، التحقيقات مع glycopolymers الاصطناعية شهدت نموا بطيئا ولكن مستمرة، مما يدل على إمكانيات كبيرة في دراسة آليات المعدية التي تشمل البحوث التي تركز على كتين الاعتراف بمعالجة 1-3. منذ glycopolymers الاصطناعية التي تمتلك الأنصاف السكر متعددي يحمل أعلى بكثير كفاءات-كتين ملزم، بالمقارنة مع الكربوهيدرات الأحادية التكافؤ، فهي من الطلب الكبير في مجال غليكوبيولوغي 3. ذات أهمية خاصة في الأبحاث السريرية هو استخدام glycopolymers الفلورسنت لتوصيف بكتيريا بوساطة كتين ملزمة مع الكربوهيدرات المتاحة على سطوح الخلايا في الجهاز التنفسي الإنسان وبروتين سكري المخاطية. في وقت مبكر من الدراسات المختبرية المستخدمة glycopolymers القائم بولي أكريلاميد متاحة تجاريا في الاختبارات ملزمة البكتيرية. أظهرت العديد من هذه التحقيقات نتائج واعدة، لكنه أثار مخاوف بشأن، obtainability، والكثير إلى الكثير الفروق في كل من بولymer الوزن الجزيئي والمحتوى glycoepitope. تم وضع بروتوكول اقتصادا في المختبر الذي من شأنه أن يوفر لعنصر تحكم مرضية من المحتويات هيكل وحجم ونقاء glycopolymers الاصطناعية التي تستهدف يكتينس البكتيرية.
بحثا عن نهج الاصطناعية مناسبة لglycopolymers، تم اختبار تقنية البلمرة جديدة نسبيا باستخدام نوع من البلمرة الجذرية للرقابة التي يعملون عكسها بالإضافة إلى ذلك، تجزئة سلسلة نقل (الطوافة) وكلاء 4. وقد تم مؤخرا استخدام هذه الكواشف RAFT في عدد قليل من الاستعدادات glycopolymer 5-7. مقارنة مع بروتوكولات إعداد glycopolymer أخرى، polymerizations بوساطة RAFT تظهر العديد من المزايا، بما في ذلك التسامح لمجموعة متنوعة من هياكل مونومر وظروف التفاعل والتوافق المحتملة مع المحاليل المائية، وانخفاض حجم التبعثر من المنتجات البوليمرية المطلوب 8،9. من بين الأماكن البارزة هي بروتوكولات لإعداد RAFT-BAglycopolymers ثلاثي مكون الحوار الاقتصادي الاستراتيجي، مما يتيح السيطرة على تركيبة أحادية مختلفة، كل منها قد يكون لها وظائف متميزة 10-13. ومع ذلك، فإن معظم الجهود البحثية السابقة إما تفتقر المصاوغ الكربونيلي الكربوهيدرات قلادة 10، أو يعملون صعدت polymerizations مما أدى إلى بوليمرات ثلاثية كتلة، التي تتكون من homopolymers مرتبطة تساهميا، والتي غالبا ما تخدم أغراضا مختلفة من البوليمرات الإحصائية التي هي بوليمرات التي تتابع مونومر بقايا تتبع قاعدة إحصائية 13/09.
في الآونة الأخيرة، ويعمل المجمع RAFT thiocarbonylthio (حمض 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate في بيئة مائية، وإعداد مجموعة من glycopolymers الإحصائية ثلاثي مكون الخطية التي تحتوي على السكريات قلادة محددة وتطبيقها في RAFT تستند للبكتيريا ملزمة بوساطة كتين وذكرت الاختبارات 14. الهدف العام من هذا الأسلوب، قدم بطريقة بصرية، هو إعداد ثلاثي مكونglycopolymers الفلورسنت الإحصائية عن طريق البلمرة تسيطر الطوافة. بسبب سهولة من بروتوكول البلمرة خطوة واحدة، ودفع غرامة السيطرة على طول البوليمر والتراكيب، واستنساخ عالية من رد الفعل، هذا البروتوكول يمكن تطبيقها بسهولة مع غيرها من التوليفات القائمة على مجموعة من glycopolymers مع الهياكل المطلوبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول سطحي وفعالة لglycopolymers ثلاثي مكون أساس RAFT-فلوري، مع وبدون الكربوهيدرات قلادة، واستخدامها في اختبار ملزم كتين، ويتجلى في هذا التقرير. يبدأ بروتوكول مع إعداد glycomonomers LAEMA وGAEMA. من خلال خطوة واحدة تسيطر عليها RAFT البلمرة، glycopolymers مع العائد استنساخه، وتكوين مونومر يمكن التنبؤ به وانخفاض التبعثر، ويتم الحصول على. التالية بعد التعديل من glycopolymers مع carboxyfluorescein succinimidyl استر، الربط من glycopolymer فلوري المسمى respective الناتجة غير قابلة للاختبار بسهولة لخصوصية ملزم كتين لها.
في الخطوات التحضيرية الأولية للglycomonomers التي هي لاستخدامها في توليفات glycopolymer اللاحقة، تم استخدام حمض lactobionic متاحة بسهولة وجلوكونولاكتون. من الناحية النظرية، أي الكربوهيدرات المصالح، من السكريات الأحادية إلى يغوساكاريدس معقدة، يمكن أن يكون المحولد لglycomonomers التي كتبها التصريف السكر الهدف على مجموعة الهيدروكسيل الأولية على C6 من الجلوكوز. بعد أكسدة الجلوكوز بقايا الحد، والجفاف لاحقا لاكتون، يمكن للمنتج ثم يكون رد فعل بسهولة مع أمين أساسي على AEMA لتشكيل glycomonomer المقابلة. ويمكن رؤية أمثلة أخرى من هذا الطريق في تقرير حديث 14. وتجدر الإشارة إلى أنه قبل الشروع في أي خطوة البلمرة، MEHQ، البلمرة المانع من امكانات، يجب إزالتها من كل مونومر وglycomonomer الاستعدادات فقط قبل استخدامها. ويتم إنجاز هذا بسهولة باستخدام الحد الأدنى من الميثانول إلى حل glycomonomer التي تمتلك MEHQ ثم التعامل معها على الفور مع الأسيتون في -20 ° C إلى ترسيب المنتجات خالية من المانع في ارتفاع العائد.
أساسية في أي نظام البلمرة الراديكالية، ويجري التركيز على الاهتمام بالتفاصيل ومونومر درجات نقاء. كما هو الحال في نظام RAFT البلمرة، وتتكون منمصدر جذري، كاشف RAFT، مونومر والمذيبات. في هذا العرض تصور، يوصف نظام RAFT البلمرة خطوة واحدة تركز على إنتاج بوليمرات الإحصائية الناتجة عن خليط التفاعل تمتلك ثلاثة مونومرات مختلفة في محلول مائي. وتعرض اثنين من ردود الفعل بوساطة RAFT منفصلة في أي واحد يستخدم لglycomonomer التي تمتلك قلادة، غير الحد محطة الكربوهيدرات (أي، β-D-سكر اللبن)، والآخر، وحيازة البوليول مع أي بقايا الكربوهيدرات منضم. مشتركة في كل من ردود الفعل بوساطة RAFT كانت أحادية تمتلك مجموعة الهيدروكسيل المفرد التي هي بمثابة جزيء الفاصل، وحيازة أخرى لأمين حرة لمرحلة ما بعد التعديل، مع fluorophore الأمينية رد الفعل.
منذ وجود الأكسجين في خليط التفاعل والبيئة تضر البلمرة RAFT بوساطة، ويتم إنجاز زواله لتتبع مستويات بسهولة عبر العديد من تجميد إيفادورات cuate ذوبان الجليد مع الحفاظ على Schlenk عاء التفاعل أنبوب تحت فراغ عالية.
تجدر الإشارة إلى أن نسبة المولي مونومرات مختلفة في رد فعل يمكن تعديلها حسب الحاجة. أيضا، من خلال تغيير كمية العامل RAFT المستخدمة، وطول البوليمرات الناتجة يمكن السيطرة عليها (18). ومع ذلك، ينبغي أن نسبة المولي من وكيل RAFT إلى البادئ يكون دائما أكبر من اثنين لضمان التبعثر منخفض للمنتج. في ظل هذه الظروف، تطور البلمرة هو ثابت، واستنساخ رد فعل مرتفع جدا. ومع ذلك، فإنه من غير المحتمل أن أحد يحصل على توزيع موحد تماما من كل أحادية المشاركة ضمن البوليمرات الإحصائية، وذلك بسبب سرعة البلمرة المختلفة. تميز توزيع مونومرات مختلفة داخل البوليمر لا تزال صعبة للغاية.
طريقة بعد التعديل، المعروضة هنا، على حد سواء amenabl أبسط وأكثره إلى استخدام مجموعة واسعة من العلامات الفلورية، بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات المطبقة على glycopolymers التسمية 2،11. وتشمل هذه الكثير للأمين رد الفعل fluorophores للذوبان في الماء، النقاط الكمومية، biotins، وغيرها. خصوصيات الملزمة لتصنيعه، glycopolymers المسمى يتم التحقق منها بسهولة باستخدام يكتينس مع الانتماءات الملزمة المعروفة. PMA-GAEMA لا تملك السكر قلادة هو السيطرة السلبية المناسبة. Glycopolymers مع مختلف العلامات الفلورية إعداد عبر هذا الطريق وقد استخدمت بنجاح في التحقيقات بوساطة كتين بكتيريا ملزما 14. كما وردت، ينبغي إعداد هذا سطحي وكفاءة glycopolymers الفلورسنت إحصائية توفر إمكانات كبيرة لمجموعة واسعة من البحوث glycobiological.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Experiment Station Chemical Laboratories of the University of Missouri, and by the Cystic Fibrosis Association of Missouri.
Materials
| Reagent | |||
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| D-Gluconolactone | Sigma-Aldrich | G2164 | |
| N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| Orange II sodium salt | Sigma-Aldrich | O8126 | |
| Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) | Sigma-Aldrich | 54050 | Polymerization inhibitor |
| N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) | Polysciences, Inc | 24833-5 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | BP-616 | |
| Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh | Sigma-Aldrich | 10343-U | |
| Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh | Sigma-Aldrich | 217514 | |
| Aluminum oxide, ~150 mesh | Sigma-Aldrich | A1522 | Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I |
| Ninhydrin | Sigma-Aldrich | N4876 | An ethanol solution of 0.2 % ninhydrin was used in the test |
| 4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid | Sigma-Aldrich | 722995 | RAFT agent |
| 4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) | Sigma-Aldrich | 11588 | Polymerization initiator |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester | Life Technologies | C1157 | |
| Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead | Vector Laboratorie | AL-1143 | |
| Solvent | |||
| dH2O | Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | A461-4 | ACS grade or better |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | ACS grade or better |
| Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | ACS grade or better |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 22705 | ACS grade or better |
| Acetone | Fisher Scientific | A929-4 | ACS grade or better |
| Equipment | |||
| Dialysis membrane (MWCO: 3,500) | Spectrum Labs | 132720 | |
| Polyethylene glycol analytical standard standard | Sigma-Aldrich | O2393 | |
| Schlenk tube, 1 mL | Quark Glass | Customized | |
| TSK-GEL G4000 PWxl | Tosoh Bioscience | 8022 | Used for GPC analysis of the glycopolymers |
| Empower 3 with GPC/SEC package | Waters Corporation | ||
| Waters Alliance HPLC system | Waters Corporation | Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475) | |
| Avance III 800 MHz NMR Spectrometer | Brucker Corporation | ||
| BX43 fluorescence microscope | Olympus Corporation | Used with FITC filter in the glycopolymer binding test | |
| Rotavap / Rotoevaporator | Heidolph | ||
| Fritted disc funnel | Fisher Scientific | 10-310-109 | |
| Lyophilizer | Labconco | ||
| Immunofluorescence microscope slide | Polysciences | 18357-1 | |
| Revco Ultima Plus -80C Freezer | Thermo Scientific | ||
| Plastic Vacuum Bag and Hand Pump | Ziploc | ||
| Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus | Fisher Scientific | ||
| Vacuum Gauge | Sargent-Welch | ||
References
- Scharfman, A., et al. Pseudomonas aeruginosa binds to neoglycoconjugates bearing mucin carbohydrate determinants and predominantly to sialyl-Lewis x conjugates. Glycobiology. 9 (8), 757-764 (1999).
- Song, E. H., et al. In vivo targeting of alveolar macrophages via RAFT-based glycopolymers. Biomaterials. 33 (28), 6889-6897 (2012).
- Wolfenden, M. L., Cloninger, M. J., Wang, B., Boons, G. .. -. J. Chapter 14. Multivalency in carbohydrate binding. Carbohydrate Recognition: Biological Problems, Methods, and Applications. , 349-370 (2011).
- Moad, G., Rizzardo, E., Thang, S. H. Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis. Polymer. 49 (5), 1079-1131 (2007).
- Spain, S. G., Gibson, M. I., Cameron, N. R. Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 45 (11), 2059-2072 (2007).
- Bernard, J., Hao, X., Davis, T. P., Barner-Kowollik, C., Stenzel, M. H. Synthesis of various glycopolymer architectures via RAFT polymerization: From block copolymers to stars. Biomacromolecules. 7 (1), 232-238 (2006).
- Bulmus, V. RAFT polymerization mediated bioconjugation strategies. Polym. Chem. 2, 1463-1472 (2011).
- Ting, S. R. S., Chen, G., Stenzel, M. H. Synthesis of glycopolymers and their multivalent recognitions with lectins. Polymer Chemistry. 1, 1392-1412 (2010).
- Vazquez-Dorbatt, V., Lee, J., Lin, E. W., Maynard, H. D. Synthesis of glycopolymers by controlled radical polymerization techniques and their applications. Chembiochem. 13, 2478-2487 (2012).
- Jiang, X., Ahmed, M., Deng, Z., Narain, R. Biotinylated glyco-functionalized quantum dots: Synthesis, characterization, and cytotoxicity studies. Bioconjugate Chem. 20 (5), 994-1001 (2009).
- Deng, Z., Li, S., Jiang, X., Narain, R. Well-defined galactose-containing multi-functional copolymers and glyconanoparticles for biomolecular recognition processes. Macromolecules. 42 (17), 6393-6405 (2009).
- Qin, Z., et al. Galactosylated N-2-hydroxypropyl methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl methacrylamide block copolymers as hepatocyte-targeting gene carriers. Bioconjugate Chem. 22 (8), 1503-1512 (2011).
- Albertin, L., Wolnik, A., Ghadban, A., Dubreuil, F. Aqueous RAFT polymerization of N-acryloylmorpholine, synthesis of an ABA triblock glycopolymer and study of its self-association behavior. Macromol. Chem. Phys. 213 (17), 1768-1782 (2012).
- Wang, W., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. RAFT-based tri-component fluorescent glycopolymers: synthesis, characterization and application in lectin-mediated bacterial binding study. Glycoconj. J. 31 (2), 133-143 (2014).
- Deng, Z., Ahmed, M., Narain, R. Novel well-defined glycopolymers synthesized via the reversible addition fragmentation chain transfer process in aqueous media. J. Polymer Sci. Part A: Polym. Chem. 47 (2), 614-627 (2009).
- Noel, S., Liberelle, B., Robitaille, L., De Crescenzo, G. Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces. Bioconjugate Chem. 22 (8), 1690-1699 (2011).
- Fox, A., Morgan, S. L., Gilbart, J., Biermann, C. J., McGinnis, G. D. Preparation of alditol acetates and their analysis by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). Analysis of Carbohydrates by GLC and MS. , 87-170 (1989).
- Thomas, D. B., et al. Kinetics and molecular weight control of the polymerization of acrylamide via RAFT. Macromolecules. 37 (24), 8941-8950 (2004).
