יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים
Summary
The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.
Abstract
הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת לנתח שבצעד חלבון מטרה, או לחלופין מולקולה קטנה, אינטראקציה עם הרכיבים של מסלול איתות. השיטה מבוססת, מצד האחד, על הביטוי מושרה של חלבון ספציפי ליזום אירוע איתות בצעד שהוגדר מראש ובמפל האיתות נבחר. ביטוי בד בבד, ומצד שני, של הגן של עניין לאחר מכן מאפשר לחוקר להעריך אם הפעילות של חלבון המטרה הביע ממוקמת במעלה הזרם או במורד הזרם של אירוע איתות יזם, בהתאם את ההודעה של מסלול האיתות שמתקבל. הנה, המפל אפופטוטיים נבחר כמסלול איתות מוגדר להפגין פונקציונלי פרוטוקול. חיידקים פתוגניים, כגון burnetii Coxiella, translocate חלבוני מפעיל שמפריעים לאינדוקצית מות תא מארח בתא המארח כדי להבטיח את הישרדות חיידקים בתא ולקדמםהפצה באורגניזם. ג חלבון מפעיל burnetii CaeB מעכב ביעילות מוות של תאי מארח לאחר אינדוקציה של אפופטוזיס עם UV-אור או עם staurosporine. כדי לצמצם את הצעד שבי CaeB מפריע להתפשטות של האות אפופטוטיים, חלבונים שנבחרו בפעילות פרו-אפופטוטיים מאופיינת היטב לידי ביטוי באופן זמני דוקסיציקלין והעין מתנהלת. אם CaeB פועל במעלה הזרם של חלבונים אלה, אפופטוזיס ימשיך ללא הפרעה. אם CaeB פועל במורד הזרם, מוות של תאים יהיה מעוכב. חלבוני הבדיקה שנבחרו היו באקס, הפועל ברמה של המיטוכונדריה, וcaspase 3, המהווה את פרוטאז התליין הגדול. CaeB מפריע למוות של תאים הנגרם על ידי ביטוי באקס, אך לא על ידי caspase 3 ביטוי. CaeB, ובכך, אינטראקציה עם המפל אפופטוטיים בין שני החלבונים האלה.
Introduction
האלימות של חיידקים פתוגנים גראם שלילי רבים תלויה במערכות הפרשה מיוחדות לחטוף תאי מארח האיקריוטים. חיידקים משתמשים במערכות הפרשה אלה להזריק חלבוני חיידקים ארסי (effectors) לתא המארח כדי לווסת את מגוון פעילויות סלולריות וביוכימיים. המחקר של חלבוני מפעיל לא רק סיפק תובנה מדהימה להיבטים בסיסיים של מארח / אינטראקציות הפתוגן אלא גם לביולוגיה הבסיסית של תאים האיקריוטים 1. אפנון של אפופטוזיס תא המארח הוכח להיות מנגנון ארסיות חשוב עבור רבים פתוגנים תאיים, ומספר חלבוני מפעיל ויסות אפופטוזיס זוהה 2-9. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המדויקים פעילותם להישאר חמקמקים במקרים רבים.
אפופטוזיס, צורה של מות תא, ממלא תפקיד חשוב בתגובה חיסונית לזיהום 10. יש שני מסלולים עיקריים שמוביל לאפופטוזיסזוהה: מיקוד מיטוכונדריה (אפופטוזיס הפנימי) או התמרה ישירה של האות באמצעות קולטני מוות של תאים בקרום הפלזמה (אפופטוזיס החיצוני). המסלול הפנימי או בתיווך מיטוכונדריה המוות של תאים מופעל על ידי אותות תאיים וכרוך בהפעלה של Bax ובק, שני חברים פרו-אפופטוטיים של משפחת Bcl-2. משפחה זה מורכב מחלבוני רגולטור בעד ונגד אפופטוטיים ששולטים תא מוות 11-14. הפעלה של אפופטוזיס מובילה לoligomerization של Bax ובק ואחריו permeabilization הבא של הקרום החיצוני של המיטוכונדריה, וכתוצאה מכך שחרור ציטוכרום C לתוך הציטופלסמה. שחרור ציטוכרום C יוזם הפעלה של caspases מפעיל 3 ו -7 באמצעות הפעלה של caspase 9 בapoptosome 15. זה מוביל לproteolysis של מצעים נבחרו ש, בין יתר, בתוצאות החשיפה של phosphatidylserine על פני תא 16 ומשחרר DNase ייעודי שברי פרקromatin 17,18.
כדי לקבוע היכן בתוך המפל אפופטוטיים חלבון מפעיל בודד מפריע, מערכת ביטוי מושרה הועסקה 19. מערכות רגולטוריות לביטוי מותנה של transgenes היו כלי רב ערך בניתוח הפונקציה של חלבון בתוך התא או חשיבותו לרקמות, איברים ופיתוח גוף, כמו גם בייזום, התקדמות ותחזוקה של המחלה 20-23. בדרך כלל, מערכות בקרה מושרה, כגון מערכת ט '24 מועסקים כאן, יוצרות יחידת שעתוק מלאכותית (ראה איור 1). מרכיב אחד הוא גורם מהונדס באופן מלאכותי שעתוק נקרא TTA (activator תעתיק טטרציקלין תלוי), שהוקם על ידי מיזוג של מדכאי שעתוק חיידקי TetR 25 לתחום חלבון יונקים שמתווך הפעלת תעתיק או השתקת 24,26. המרכיב השני הוא היברידיאמרגן, כינה TRE (אלמנט טטרציקלין מגיב), בהיקף של אמרגן מינימאלי אוקריוטים, המכיל לפחות TATA-תיבה ואתר ייזום שעתוק, הצטרף לחזרות מרובות של אתר ה- DNA מחייבת אותו המקור לTetR, TETO 24,25. המרכיב השלישי הוא יגנד הטבעי של TetR, טטרציקלין או אחד מנגזרותיו, כגון anhydrotetracycline או דוקסיציקלין 25. עם בנוסף ליגנד למדיום התרבות, TetR מאבד זיקתה לTETO ומנתק מTRE. כתוצאה מכך, שעתוק של גן המטרה הוא בוטל. ביטוי transgene יכול, ובכך, להיות מבוקר היטב באופן זמן ותלוי-מינון בשתי תרבית התאים ובחיות 20,23,24. עם TTA, ביטוי transgene מתרחש constitutively, אלא בנוכחות של טטרציקלין. זה יכול להיות חסרון בחקר חלבונים רעילים לתאים סרטניים או בגלל טטרציקלין יש ראשון שהוסר מהמערכת, לפני שהשתקף transgenen מתרחש וניתן לנטר את ההשפעות של חלבון המטרה בתא. זה יכול להיות זמן רב ולא תמיד מלא, במיוחד בבעלי חיים מהונדסים 27. כדי לטפל במגבלה זו, מוטציה TetR עם תגובה הפוכה לנוכחות של דוקסיציקלין שימשה כדי ליצור גורם שעתוק חדש, rtTA (הפוך TTA) 28. זה רק נקשר לTRE ו, במקביל, מפעיל שעתוק בנוכחות דוקסיציקלין. דליפות שייר של המערכת, כלומר., ביטוי transgene בהעדר גורם שעתוק קשור-TRE, שמקורו גם (i) מהשפעות עמדה באתר אינטגרציה הגנומי, (ii) מTRE עצמו 29, או (iii) שמאינו -specific מחייב של TTA / 28 rtTA, היה ממוען על ידי החדרת משתיק תעתיק נוסף, כינה TTS (משתיק קול תעתיק טטרציקלין תלוי) 30 למערכת. הוא יוצר רשת רגולטור כפולה יחד עם rtTA (ראה איור 1).בהעדר דוקסיציקלין, TTS נקשר לTRE ופעיל כיבוי כל שעתוק שנותר. בנוכחות של דוקסיציקלין, TTS dissociates מTRE וrtTA נקשר בו זמנית גרימת ביטוי של גן המטרה. שכבה נוספת זו של החמרה לעתים קרובות יש צורך לבטא את החלבונים רעילים לתאים פעילים מאוד 31-34.
שימוש במערכת כפול רגולטור לפיקוח הדוק זה, המפל אפופטוטיים יכול להיות יזם בצעד שהוגדר מאפשר ניתוח של האם חלבון מפעיל נתון יכול להפריע אינדוקציה אפופטוזיס. שיטה זו יכולה לא רק לשמש כדי לחקור את הפעילות האנטי-אפופטוטיים של חלבוני מפעיל חיידקים, אלא גם לביטוי מושרה של חלבונים פרו-אפופטוטיים או רעילים, או לנתח הפרעה למסלולי איתות אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
חיידקים פתוגניים רבים נמל מערכות הפרשה להפריש או translocate חלבוני מפעיל חיידקים לתוך התא המארח. יש חלבוני מפעיל אלה את היכולת לווסת את התהליכים ומסלולים בתא המארח, ומאפשר לחיידקים לשרוד ולשכפל בתוך הנישה תאית שלהם. הבנת הפעילות ביוכימית והמנגנונים המולקולריים של חלבונ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.
Materials
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |
References
- Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
- Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
- Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
- Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
- Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
- Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
- Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
- Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
- Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
- Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
- Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
- Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
- Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
- Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
- Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
- Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
- Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
- Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
- Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
- Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
- Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
- Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
- Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
- Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
- Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
- Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
- Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
- Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
- Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
- Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
- Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
- Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
- Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
- Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
- Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
- Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
- Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).
