Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

Die Virulenz von vielen Gram-negative bakterielle Erreger hängt von spezialisierten Sekretionssysteme zu eukaryotischen Wirtszellen zu entführen. Bakterien nutzen diese Sekretionssysteme bakterieller Virulenzproteine ​​(Effektoren) in die Wirtszelle injiziert werden, um eine Vielzahl von zellulären und biochemischen Aktivitäten modulieren. Das Studium der Effektorproteine ​​nicht nur bemerkenswerten Einblick versehen, in grundlegende Aspekte der Wirt / Pathogen-Interaktionen als auch in die grundlegende Biologie von eukaryotischen Zellen ^1. Modulation der Wirtszelle Apoptose wurde gezeigt, dass ein wichtiger Mechanismus für die Virulenz viele intrazelluläre Pathogene zu sein, und eine Anzahl von Effektor-Proteine ​​modulieren Apoptose identifiziert wurden ^2-9. , Ihren genauen molekularen Mechanismen der Tätigkeit bleiben jedoch schwer in vielen Fällen.

Apoptose, eine Form des programmierten Zelltods, spielt eine wichtige Rolle bei der Immunantwort auf eine Infektion ^10. Zwei Hauptwege, die zu Apoptose habenidentifiziert: zur Förderung der Mitochondrien (intrinsische Apoptose) oder direkte Weiterleitung des Signals über den Zelltod-Rezeptoren an der Plasmamembran (extrinsische Apoptose). Die intrinsische oder Mitochondrien vermittelte Zelltod wird durch intrazelluläre Signale ausgelöst und beinhaltet die Aktivierung von Bax und Bak, zwei proapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie. Diese Familie wird von pro- und anti-apoptotischen Regulatorproteine, die den Zelltod ^11-14 steuern zusammen. Die Aktivierung der Apoptose führt zu Oligomerisierung von Bax und Bak, gefolgt von nachfolgenden Permeabilisierung der mitochondrialen Außenmembran, was zu einer Freisetzung von Cytochrom c in das Zytoplasma. Freisetzung von Cytochrom c initiiert Aktivierung der Effektor-Caspasen 3 und 7 durch die Aktivierung von Caspase-9 in der apoptosome ^15. Dies führt zu einer Proteolyse von ausgewählten Substraten, die unter anderem führt die Exposition von Phosphatidylserin an der Zelloberfläche ¹⁶ und befreit einen dedizierten DNase, die CH-Fragmentenromatin ^17,18.

Um zu bestimmen, wo innerhalb der Apoptosekaskade eine individuelle Effektorprotein stört, wurde ein induzierbares Expressionssystem ¹⁹ eingesetzt wird. Regulierungssysteme für die bedingte Expression von Transgenen wurden ein wertvolles Werkzeug in der Funktion eines Proteins innerhalb der Zelle oder ihrer Bedeutung für Gewebe, Organ und Entwicklung des Organismus, als auch während der Initiation, Progression und Wartung der Krankheit ^20-23 analysiert. Typischerweise induzierbare Kontrollsysteme, wie das Tet-System ²⁴ hier verwendet wird, bilden einen künstlichen Transkriptionseinheit (siehe Abbildung 1). Eine Komponente ist eine künstlich konstruierte Transkriptionsfaktor genannt tTA (Tetracyclin-abhängige Transkriptionsaktivator), durch Fusion des bakteriellen Transkriptionsrepressor TetR ²⁵ an einen Säugetier-Protein-Domäne, die die transkriptionale Aktivierung vermittelt oder Schalldämpfer ^24,26 gebildet. Die zweite Komponente ist ein HybridPromotor bezeichnet TRE (tetracycline-responsive element), bestehend aus einem eukaryontischen minimalen Promotor, mindestens eine TATA-Box und eine Transkriptionsinitiationsstelle enthält, verbunden mit mehrfachen Wiederholungen der passenden DNA-Bindungsstelle für TetR, tetO ^24,25. Die dritte Komponente ist der natürliche Ligand von TetR, Tetracyclin oder eines seiner Derivate, wie Anhydrotetracyclin und Doxycyclin ^25. Bei Ligandenzugabe zum Kulturmedium verliert TetR seine Affinität für tetO und distanziert von der TRE. Als Ergebnis wird die Transkription des Zielgens aufgelöst. Transgen-Expression kann somit fest in einer zeit- und dosisabhängigen Art und Weise sowohl in der Zellkultur und in Tier ^20,23,24 gesteuert werden. Mit tTA tritt Transgen-Expression konstitutiv, außer in Gegenwart von Tetracyclin. Dies kann ein Nachteil in der Studie von cytotoxischen oder onkogene Proteine ​​sein, weil Tetracyclin zunächst vom System entfernt werden, bevor Transgen expression erfolgt und Wirkungen des Zielproteins auf der Zelle überwacht werden. Dies kann zeitaufwendig sein und ist nicht immer vollständig, insbesondere in transgenen Tieren ^27. Um diese Einschränkung zu beheben, wurde ein TetR-Mutante mit einer umgekehrten Reaktion auf die Anwesenheit von Doxycyclin verwendet, um einen neuen Transkriptionsfaktor zu erzeugen, rtTA (reverse tTA) ^28. Es bindet nur an dem TRE und damit einhergehend die Transkription in Gegenwart von Doxycyclin. Restundichtheit des Systems, dh., Transgen-Expression in Abwesenheit von TRE-gebundenen Transkriptionsfaktor Ursprung entweder (i) von Positionseffekten in einer genomischen Integrationsstelle, (ii) von der TRE selbst ²⁹ oder (iii) aus nicht -spezifische Bindung von tTA / rtTA ²⁸ wurde durch Einführung eines zusätzlichen transkriptionalen Schalldämpfer gerichtet, sogenannte TTS (Tetracyclin-abhängige Transkriptions Schalldämpfer) ³⁰ an das System. Es bildet sich ein Zweiregler Netzwerk zusammen mit rtTA (siehe Abbildung 1).In Abwesenheit von Doxycyclin, bindet TTS TRE und schaltet alle verbleibenden Transkription aktiv. In Gegenwart von Doxycyclin, distanziert tTS von TRE und rtTA bindet gleichzeitig Induktion der Expression des Zielgens. Diese zusätzliche Schicht aus Stringenz ist oft notwendig, hochaktive zytotoxische Proteine ^​​31-34 exprimieren.

Mit diesen streng kontrollierten Doppelregler-System kann die Apoptosekaskade bei einer definierten Schritt kann Analysen, ob die gegebene Effektorprotein mit Apoptose stören initiiert werden. Dieses Verfahren kann nicht nur verwendet werden, um die anti-apoptotische Aktivität von bakteriellen Effektorproteine ​​studieren, sondern auch für die induzierbare Expression von pro-apoptotischen oder toxische Proteine ​​oder zum Präparieren Interferenzen mit anderen Signalwegen.