施加诱导表达系统研究与细胞内信号细菌毒力因子的干扰

许多革兰氏阴性细菌病原体的毒力取决于专门的分泌系统劫持真核宿主细胞。细菌利用这些分泌系统注入细菌毒性蛋白（效应物）到宿主细胞来调节各种细胞和生化活性。效应蛋白的研究不仅提供了卓越的洞察宿主/病原体相互作用的基本方面，但也到真核细胞¹的基础生物学。宿主细胞凋亡的调节已被证明是一种重要的毒力机制的许多细胞内病原体，和一些效应蛋白调节细胞凋亡已经确定^2-9。然而，他们的活动的精确的分子机制仍然是难以捉摸的，在许多情况下。

细胞凋亡，程序性细胞死亡的一种形式，在免疫应答中起重要作用，以感染^10。导致细胞凋亡的两个主要途径有已经确定：针对线粒体（内在凋亡）或信号的直接转导通过细胞死亡受体在质膜（外源性凋亡）。本征或线粒体介导的细胞死亡途径由细胞内信号所触发的，并涉及Bax和Bak的，所述的Bcl-2家族的两个促凋亡成员的活化。这家由控制细胞死亡^11-14亲和抗凋亡调节蛋白。细胞凋亡的激活导致低聚的Bax和Bak的后跟线粒体外膜的随后通透性，导致细胞色素C释放到细胞质中。细胞色素c释放引发的凋亡小¹⁵激活效应半胱氨酸蛋白酶3和7通过激活caspase 9的。这导致选择底物，除其他外，导致磷脂酰丝氨酸在细胞表面¹⁶的暴露的蛋白水解，并释放一个专用的DNase该片段沟道romatin ^17,18。

为了确定在凋亡级联的个体效应蛋白干扰内，可诱导的表达系统被雇用^19。管制系统，转基因的条件式已在分析过程中发生，发展和维持疾病^20-23的细胞内的蛋白质的功能或它的对组织，器官和生物体发展的重要性，以及一个宝贵的工具。典型地，可诱导的控制系统，如四环素系统²⁴在这里使用的，形成人工转录单位（参见图1）。一种成分是一种叫做tTA的（四环素依赖性转录激活剂）人工工程转录因子，通过融合的细菌转录阻遏四面体²⁵到介导转录激活或沉默^24,26的哺乳动物蛋白结构域形成。第二组分是一种混合启动子，称为TRE（四环素响应元件），它由一个真核最小启动子的，含有至少一个TATA盒和转录起始位点，结合到同源DNA结合位点为四面体，TETO ^24,25的多个重复。第三成分是四面体，四环素或其衍生物，如无水四环素或强力霉素²⁵之一的天然配体。在配体加入到培养基中，四面体失去其亲和力TETO并从TRE解离。其结果，靶基因的转录被废除。转基因表达可以，因此，被严格控制在两个细胞培养物以时间和剂量依赖的方式和在动物^20,23,24。与tTA的，转基因的表达发生组成型，除了在四环素存在下进行。这可以是在细胞毒性或致癌蛋白的研究一个缺点，因为四环素首先必须从体系中除去，转基因expressio前n，将会和可监控单元上的靶蛋白的影响。这可能是耗时的并且不总是完全，特别是在转基因动物^27。为了解决此限制，一个四面体突变体具有逆响应于多西环素的存在被用来产生新的转录因子，rtTA（反向^TTA）28。它仅结合于TRE和，伴随，激活在强力霉素存在下转录。的系统， 即残余泄漏，在不存在TRE结合转录因子的转基因表达，始发或者（i）从位置效应在基因组整合位点，（ⅱ）从TRE本身^29，或（iii）来自非特异性tTA的/ rtTA ²⁸的结合，是通过引入一个附加的转录消音处理，称为TTS（四环素依赖的转录的消音器^）30到系统。它形成了一个双重调节网络一起rtTA（ 见图1）。在没有强力霉素，TTS结合TRE积极关闭任何剩余的转录。在强力霉素存在时，TTS解离TRE和rtTA具约束力同时诱导靶基因的表达。严紧的这个附加层往往是必要的，表达高活性细胞毒性蛋白质^31-34。

使用这种严格控制的双调节器系统，细胞凋亡级联可以在限定的步骤，使给定的效应蛋白是否能够与细胞凋亡诱导干扰分析来启动。这种方法不仅可用于研究细菌效应蛋白的抗凋亡活性，但也可用于促凋亡或有毒的蛋白质的诱导表达，或用于解剖与其他信号传导途径的干扰。