생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해
Summary
To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.
Abstract
혈관 감염 심내막염 발생할하기 위해, 박테리아는 흐르는 혈액의 전단 응력에 노출 된 상태로 혈관 벽에 부착 할 수 있어야한다.
미생물의 부착에 기여하는 혈관 박테리아 및 숙주 요인을 파악하기 위해, 전단 생리적 조건 하에서 이러한 상호 작용을 연구 적절한 모델이 필요하다. 여기서, 우리는 세포 외 기질의 서로 다른 컴포넌트에 세균 밀착성을 조사하기 위해 또는 내피 세포 받을수 관내 유동 챔버 모델을 설명하고 개발 된 생체 내에 현미경 모델이 직접 생체 내에 내장의 순환에 박테리아의 초기 밀착성을 시각화 . 이러한 방법은 기류 하에서 박테리아의 부착에 필요한 박테리아 및 숙주 요인을 파악하기 위해 사용될 수있다. 우리는 전단 응력의 관련성과 Staphy의 접착 폰 빌레 브란트 인자의 역할을 도시lococcus 구균 모두 시험 관내 및 생체 내 모델에서 사용.
Introduction
To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1.
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood.
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest.
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4.
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.
Protocol
Representative Results
Discussion
전단 응력은 혈관 벽에 초기 세균 접착 및 혈관 내 또는 심 내막 식생 및 전이성 감염 4,5의 다음 세대를위한 중요한 요소이다. 우리는 생리적 전단 응력에 따라 혈관 내 감염의 발병 기전을 연구하기 위해 생체 외 및 생체 내 모델에서 보완 설명했다. 이 모델은 우리가 주요 S.으로 폰 빌레 브란트 인자 결합 단백질 (vWbp)를 식별 할 수있다 구균 단백질은 VWF 4 노출 부상 혈관 벽 흐름에서 상호 작용할 수 있습니다.
혈관 내 감염, 특히 감염성 심내막염뿐만 아니라, 때문에 로컬 및 원격 ( '전이') 합병증뿐만 아니라, 때문에 패혈증에 의한 장기 부전 및 사망의 우려이다. 심내막염과 전이성 감염을 일으키는 세균이 혈관 벽에 부착함으로써 흐르는 혈액의 전단 응력에 저항해야한다. 가장세균에 대한 연구는 요인 정적 조건에서 수행 된 독성. 그러나 이러한 설립 상호 작용은 세균 호스트 상호 작용의 새로운, 이전에 인식 할 수없는 요인을 밝힐 수 유량 조건에서 전단력과 연구를 견딜 수 있습니다.
마이크로 병류 챔버를 사용하여, 그리고 다른 혈관 접착 VWF의 중요성을 보여준다. 전단 응력에서 점진적가 전개 될 그 휴식 구형 구조에서 VWF하고는 GPIB 수용체 (6)를 통해 혈소판과 상호 작용 A1 도메인을 제공합니다. 흐름 챔버 광범위 혈소판 기능 (7)을 연구하기 위해 사용되었다.
놀랍게도, 또한 S. 유동하 구균 밀착성 전단에 노출 A1 도메인 VWF 필요하며, 특히. 우리는 vWbp는 VWF 바인딩 중재 확인했다. vWbp은 S.에 기여하는 응고 효소이다 호스트의 프로트롬빈을 활성화하여 구균의 병태 생리. Staphylothrombin, 입술세균 응고 효소와 프로트롬빈의 복잡한을 ulting, 불용성 섬유소 8,9에 피브리노겐을 변환합니다. 우리의 연구 vWbp 만 프로트롬빈을 활성화시키지 않는 것을 도시하지만, 유동 4,10,11 하에서 혈관 밀착성을 향상 박테리아 피브린 혈소판 집합체의 형성을 유발 하였다.
체외 유량 용기 모델은 세포 또는 매트릭스 구성 요소에 세균 부착에 다른 선수를 연구 할 수 있습니다. 박테리아 병원성 인자는 특정 표면 단백질을 발현하는 돌연변이 또는 무해한 균을 이용하여 연구 될 수있다. 대안으로, 약물 억제제 또는 차단 항체는 유동 챔버 내의 매질에 첨가 될 수있다. 그러한 세포 외 기질의 다른 구성 성분으로서 숙주 인자의 역할은 서로 다른 코팅으로 커버 슬립을 이용하여 연구 될 수있다. 커버 슬립은 활성화 상태가 특정한 자극을 추가하여 변조 될 수있는 내피 세포로 피복 될 수있다. 아파혈관벽에서 RT는, 숙주 세포 및 혈액 혈장 단백질의 기여는 유동 매체에 이들 인자를 첨가하여 연구 될 수있다. 따라서, 증가하는 복잡성의 다른 조건은 세균이 생체 내에서 혈관 벽에 부착 할 수 있도록 상호 작용을 해명 층류의 표준화 된 조건에서 연구 될 수있다.
체외 모델에서 확인 된 상호 작용은 이후 복잡한 유기체의 관련성을 테스트하기 위해 동물 모델에서 공부하고 있습니다. 흐름에 따라 동적 상호 작용을 연구하는 생체 내 모델에서 다른 하나는 같은 햄스터의 지느러미 피부 집계 챔버 (12)와 cremaster 모델 (13)로, 기술되었다. 이에 비해, 여기에서 설명 장간막 관류 모델 가능성 마우스의 유전 적 배경을 호스트 다양하고 약리 개입을 평가하기 때문에 사용의 용이성의 여러 가지 이점을 제공한다.
결론적으로, 모델 바와S의뿐만 아니라 표면 단백질을 연구 할 수있는 가능성을 제공합니다 구균,하지만 다른 호스트 배경에 다른 많은 미생물의 더 나은 혈관 감염의 발병 기전을 이해합니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 퐁 voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) 데런 G0466.10, 11I0113N에 의해 지원되었다; 소아 심장과, UZ 루벤, 벨기에 "에디 멕스 연구비"와 "SPORTA 연구 그랜트"(JC); 분자 및 혈관 생물학 센터는 루벤 대학에서 "Geconcentreerde Onderzoeksacties"(GOA 13분의 2,009)과 베링거 인 겔 하임의 연구 보조금에 의해, Programmafinanciering KU 루벤 (PF / 10 / 014)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Brain Heart Infusion (BHI) | BD Plastipak | 237500 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Oxoid | CM0129 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-169 | D-PBS |
| 5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21878-25MG-F | fluorescent labeling |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roch | 10 735 086 001 | |
| Haemate-P | CSL Behring | PL 15036/0010 | VWF |
| Horm collagen | Takeda | 10500 | collagen |
| 1-well PCA cell culture chambers | Sarstedt | ######## | plastic slips |
| Temgesic | Reckitt Benckiser | 283716 | bruprenorphine |
| Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum)) | Eurovet | BE-V136516 | ketamin |
| XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)) | VMD Arendonk | BE-V170581 | xylazine |
| 2 french intravenous catheter green | Portex | 200/300/010 | |
| 0,9% Sodium chloride (NaCl) | Baxter Healthcare | W7124 | |
| cotton swabs | International Medical Product | 300230 | |
| Ca2+-ionophore solution A23187 | Sigma-Aldrich | C7522-10 MG | |
| 26 gauge 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| 26 gauge 1 ml syringe with needle | BD Plastipak | 300015 | intra-peritoneal injection |
| Centrifuge 5810-R | Eppendorf | 5811 000.320 | |
| Glass cover slips (24×50) | VWR | BB02405A11 | Thickness No, 1 |
| PHD 2000 Infusion | Harvard Apparatus | 702100 | High-accuracy Harvard infusion pump |
| Axio-observer DI | Carl-Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
| ImageJ | National Institute of Health | Analysis software | |
| Graphpad Prism 5,0 | Graphpad Software | Analysis software | |
| AxioCam MRm | Carl-Zeiss | Black and white camera | |
References
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