세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em> Coxiella burnetii의</em> 트랜스포존 돌연변이
Summary
Coxiella burnetii의는 인수 공통 질병 Q 열병에 대한 책임 의무적 세포 내 그람 음성 세균이다. 여기에서 우리는 Coxiella 형광 트랜스포존 돌연변이의 발생뿐만 아니라 자동 식별 및 결과 국제화, 복제 및 세포 독성 표현형의 분석 방법을 설명합니다.
Abstract
내습 및 세균성 병원균에 의한 숙주 세포의 콜로니가 파괴 및 키 호스트 기능을 조작 할 수있는 독성으로 정의 원핵 인자 단백질의 다수의 활성에 의존한다. 호스트 / 병원균 상호 작용의 연구는 세균 감염을 이해하고 전염성 질환에 대응하기 위해 대체 전략을 개발하는 것이 매우 중요하다. 이 방법은 그러나, 세균 독성 결정의 편견, 자동 식별 및 특성화를위한 새로운 높은 처리량 분석의 개발이 필요합니다. 여기서는 트랜스포존 돌연변이 유발에 의해 GFP 표지 된 돌연변이 체 라이브러리를 생성하는 방법을 설명하고 높은 콘텐츠 스크리닝의 개발은 여러 트랜스포존 관련 표현형의 동시 식별에 접근한다. 우리의 작업은 SE 모델과 연관된 세포 내 세균 병원체 Coxiella burnetii의, Q의 동물 원성 감염증의 발열 병인 에이전트이며베르는 필연적 건강과 경제적 부담으로 발병이. 이 병원균의 의무적 세포 내 성격은, 최근까지 심각한 Coxiella의 높은 처리량 / 높은 콘텐츠 접근 방식의 구현을위한 이상적인 모델을 만들고, 호스트 병원체 상호 작용에 관여하는 세균 요인의 식별을 방해하고있다.
Introduction
신흥, 풍토 박테리아 Coxiella burnetii는 Q의 발열, 심한 건강과 경제에 미치는 영향 1 쇠약 독감 등 인수 공통 질병의 대규모 발생에 대한 책임이 있습니다. Coxiella의 주요 저수지 국내 및 농장 동물, 이는 US의 젖소의 90 % 이상을 가지고 C. 것으로 추정되고 2 burnetii. 인간은 오염 된 에어로졸의 흡입에 의해 감염 우발적 호스트입니다. 인간의 Q 열이 명단 중 65 % 1,3에 도달 사망률과 치명적인 합병증을 가질 수있는 급성 또는 만성 질환, 등. (1)의 감염 복용량 – 10 생물, Coxiella 알려진 가장 전염성 병원체이며, 그것은 잠재적 인 생물 무기 (4)로 조사되었다. 네덜란드 (2,007에서 2,010 사이)에서 Q 열병의 최근 폭발 발생의 경우 연간 2,000에 182에서 확대와 함께,이 병원균의 심각한 독성의 예를 들어 서5.
Coxiella 감염의 놀라운 효율은 가능성이 세포를 호스트하는 독특한 적응과 함께 환경 스트레스에 대한 저항과 관련이있다. 실제로, Coxiella 여러 가혹한 조건 (탈수, 온도 등)에 대한 내성이 현저하게 대사 비활성 소세포 변이체 (SCV) 형태의 환경에 존재한다. 비 식세포의 침윤이 Coxiella 접착 / 침입하는 OmpA 7 아직 미확인 수용체에 의해 매개되는 동안 SCVs 최대 3 인테그린 6 β α의 V를 통해 식세포에 의해 촬영된다. 흡수 후, Coxiella은 Rab5 및 EEA1 8 초기 엔도 좀 마커에 대한 긍정적 인 꽉 끼는 액포,에 있습니다. 박테리아는 도트 / ICM 4 형 분비 시스템 (T4SS) (9) 대사 활성 대 세포 변형 (상용차)로 변환하고 활성화하여 엔도 좀의 산성화에 응답, 레지오넬라 뉴모 필라 (10)의 고도로 상동. 도트 / ICM 이펙터의 분비 Coxiella 박테리아가 번성하고 적극적 아폽토시스 11에서 감염된 세포를 보호 할 수있는 활성 리소좀 효소를 포함하는 대형 LAMP1 양성 산성 칸을 생성 할 수있다. 따라서, Coxiella의 세포주기 세균성 이펙터 (12)의 도트 / ICM 매개 전위에 의해 제어된다, 그러나, 숙주 세포 침윤, 박테리아 복제 및 감염의 보급에 관련된 미생물의 미지의 요인이 크게 남아있다.
숙주 세포 내에서 1) 내재화, 2) 세포 내 복제, 3) 셀 간 전파 : 트랜스포존 돌연변이 유발 및 형광 계 분석을 결합하여, 우리는 Coxiella 감염의 주요 단계에 관여하는 박테리아 인자의 동시 식별 공평 접근법을 개발 및 4) 지속성. 지금까지 우리는 1,000m에 걸쳐 상영 한Coxiella의 병인 (7)을 조절 호스트 병원체 상호 작용에 대한 전례없는 통찰력으로 우리를 제공하는 500 Coxiella 코딩 시퀀스에서 utations. 참고로,이 접근법은 Coxiella으로 세포 생물학 기능을 공유하는 다른 세포 내 병원체의 연구에 적용될 수있다.
Protocol
GFP – 태그 Coxiella의 트랜스포존 돌연변이의 라이브러리의 1 세대 현지 법률을 준수 미생물 안전 캐비닛 (MSC)에서 바이오 안전성 봉쇄 레벨 2 (BSL-2)에 Coxiella burnetii RSA439 NMII을 조작 할 수 있습니다. 사용 된 세균 모델과 호환 경우 1.4.1에서 1.4.4에 반복 단계 클론 변이체를 획득하는 확률을 증가시키기 위해. 전형적인 변이체 라이브러리는 구성된다 (적어도) 사용 유기체의 게놈 주석 코딩 서열 3 배 수와 동일한 돌연변이의 수. electrocompetent Coxiella RSA439 NMII의 준비 : 13.4 mM의 시트르산, 16.1 mM의 시트르산 나트륨, 3.67 mM의 인산 칼륨, 1 mM의 염화 마그네슘, 0.02 mM의 염화칼슘, 0.01 mM의 철 설페이트, 125.4 mM 염화나트륨, 1.5 밀리미터 L 시스테인 0.1 g : 1X ACCM-2 (13)를 준비 / L 박토 Neopeptone, 2.5 G / 리터 카사 미노산, 1g / L 메틸 베타 사이클로 덱스트린, 125 ㎖ / L의 RPMI. 4.75 및 필터 소독 (오토 클레이브하지 않음)로 산도를 조정합니다. 참고 : 액체 ACCM-2는 약 1 개월, 4 ℃에서 안정하다. -80 ° C 주식에서 (이전에 생성 단계 1.5에서와 같이 정량화 세균 재고) 2 × 10 6 게놈 상당 (GE) Coxiella RSA439 NMII의 / ㎖로 ACCM-2 100 ㎖를 접종하고 75 세균 현탁액을 배포 (- 플라스크 당 세균 현탁액을 15 ml의 10) 환기 캡 CM 2 세포 배양 플라스크. 5 % CO 2 및 2.5 %, O (2)의 가습 분위기에서 37 ℃에서 7 일간 재배한다. 4 ℃에서 1 시간 동안 3,900 XG에서 결과 세균 50 ㎖ 튜브에 서스펜션과 원심 분리기를 풀. 뜨는을 취소하고 10 % 글리세롤의 30 ml의 펠렛을 재현 탁. 4 ℃에서 1 시간 동안 3,900 XG에 원심 분리기. 10 % 글리세롤 (전형적으로 2 ml) 및 500 ㎕의 분취 액을 튜브에 50 μL의 충분한 부피로 펠렛을 재현 탁. 재 부유 B를 유지전체 과정 동안 얼음에 acteria. 주 :이 단계에서, 박테리아는 electrocompetent이며 하나 분취 한 전기 천공을 수행하기에 충분하다. 박테리아 현탁액은 6 개월 -80 ° C에서 저장 될 수 있거나 직접 플라스미드 DNA의 전기 천공을 위해 사용된다. transposon- 및 트랜스 코딩하는 플라스미드와 능력 Coxiella의 전기 : 주 : 다음 프로토콜, transposable 요소와 트랜스가 (각각, PITR-CAT-GFP 및 pUC19를-Himar1C9) 두 개의 서로 다른 플라스미드에 의해 인코딩된다 (7). Coxiella에서 일렉트로 때 두 플라스미드 그들에게 자살 플라스미드를 제작, Coxiella 특정 복제 기원이 부족하다. 이는 안정적인 트랜스포존 삽입을 보장합니다. transposable 요소는 선택을위한 Coxiella 프로모터 p1169와 GFP에 생성 된 돌연변이에 태그를 Coxiella 프로모터 P311의 규제에서 GFP 유전자의 규제에서 클로람페니콜 저항 카세트가 포함되어 있습니다. 홍보얼음에 10 분 동안 0.1 cm의 전기 큐벳을 전자 냉각. 50 10 μg의 트랜스포존 플라스미드 electrocompetent Coxiella의 μL 및 트랜스 플라스미드 (7)의 10 μg의 혼합. 플라스미드 농도가 글리세롤의 희석을 최소화하는보다 높은 500 μg의 / ml 인 것을 확인. 다음 설정을 사용하여 Electroporate : 18 kV로, 500 Ω, 25 μF. 결과 시정 9, 13 밀리 초 사이에 포함되어 있는지 확인합니다. 즉시, RPMI의 950 μl를 추가 일렉트릭 박테리아를 재현 탁과 스크류 캡 튜브에 전송하고, 실온에서 보관하십시오. 일렉트로 박테리아의 200 μl를 취하여 6 웰 플레이트에 1 % 열 – 불 활성화 태아 소 혈청 (FBS)으로 보충 ACCM -2- 3ml를 추가. 일렉트로 세균의 잔존 부피 DMSO 88 μL를 추가 -80 ° C에서 저장 (10 % DMSO의 최종 농도를 달성하기 위해). 트랜스포존 돌연변이의 선택 : IncubaTE 5 % CO 2 및 2.5 % O 2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 하룻밤 (1.2.4) 전술 한 바와 같이 접종 한 6- 웰 플레이트. 적절한 항생제를 추가 (375 μg의 / ㎖ 카나마이신 또는 3 μg의 / ㎖ 클로람페니콜). 위에 설명 된 조건에 추가로 3 일 동안 박테리아 문화를 품어. 개인 돌연변이의 분리 : Coxiella 트랜스포존 돌연변이 고체 ACCM -2- 판의 제조 및 도금 참고 : 다음은 1 페트리 접시를 들어, 박테리아 문화의 여러 희석이 식민지 격리를위한 최적의 접종 볼륨을 평가하기 위해 테스트를 할 필요가 있습니다. 전자 레인지에 아가로 오스 10.5 ml의 0.5 %의 히트와 55 ° C의 물을 욕조에 식힌다. 37 ° C에서 (PH 4.75) 배 ACCM-2 11.25 mL를 가열한다. 아래 아가로 오스를 준비합니다 : 적절한 항생제를 아가 배 ACCM-2의 10 ml의 용융 0.5 % 10 ml의 혼합 및 추가 (375 μg의 / ㎖ 카나마이신 또는 3μg의 / ㎖ 클로람페니콜). 페트리 접시에 즉시 따르십시오. 30 분, 자연 건조 20 분 동안의 중간 식도록, 페트리 접시 unlidded을 유지합니다. 상단 아가로 오스를 준비합니다 : 적절한 항생제 (375 μg의 / ㎖ 카나마이신 또는 3 μg의 / ml의 클로람페니콜)를 첨가하고, 37 ° C에서 배양, 5 ㎖ 폴리스틸렌 튜브에 물 0.75 ㎖로 2 배 ACCM -2- 1.25 mL를 섞는다. 5 초 동안 세균 배양 (일반적으로 1 μL 100)와 소용돌이를 추가합니다. 녹은 아가로 오스의 0.5 ML을 추가 혼합 바로 아래 아가로 오스에 붓는다. 20 분 아가로 오스의 응고를 촉진하기 위해, 20 분 동안 냉각 페트리 접시에 뚜껑을 교체하고 4 ℃에서 부화 할 수 있습니다. MSC에 unlidded 20 분 동안 공기 건조. 6~7일 대해 5 % CO 2 및 2.5 %, O (2)의 가습 분위기에서 37 ℃에서 플레이트를 성장한다. 나머지 박테리아에 DMSO를 추가위해 L의 문화 -80 ° C에서 최종 10 % DMSO의 농도 및 저장에 도달. 다음과 같이 최적의 희석을 평가 : 식민지 직경 0.5-1 MM은 제대로 교차 오염을 방지하기 위해 격리되어 있는지 확인합니다. 1.4.1.2 및 1.4.1.3에 설명 된대로 ACCM-2 한천에 적절한 희석 점 1.4.2과 접시에서 세균 배양 남은 해동. 1.4.1.3.5에 기술 된 바와 같이 6-7일 품어. 콜로니 감지가되면, 1 mL의 팁 단부 절삭 플러그 따기 절연 콜로니를 함유 ACCM -2- 1.5 mL의 적절한 항생제를 포함하는 (375 μg의에 피펫 팅하여 콜로니를 분산시켜 그들을 수집 / ㎖ 카나마이신 또는 3 μg의 / 24 웰 플레이트에 ML의 클로람페니콜). 1.3.1에 설명 된 조건 6 일 동안 개별 식민지를 증폭. 배양 3 일에, 각각의 문화를 피펫 팅하여 세균 덩어리를 분산. 10에서 96 웰 플레이트에 2D 바코드 screwcap 튜브의 각 돌연변이 정지를 저장-80 ° C에서 %의 DMSO. 세균 농도의 평가 : 주 : 다음 프로토콜 무균 배지에서 돌연변이 세균 복제 (1.4.4 참조)의 성장 곡선을 얻기 위해 적용될 수있다. 표준 곡선의 준비 : dsDNA의 2 μg의 / ㎖ 원액 1X 트리스 – EDTA (TE)에 (알려진 크기와 농도 일반적으로 임의의 플라스미드)를 준비합니다. 2 μg의 / ㎖로부터 2 NG / ㎖ 범위의 농도를 구하는 스톡 용액으로부터 10 배 희석액을 준비한다. 검은 벽과 바닥 96 웰 마이크로 단일 우물에 각 농도의 50 μl를 분배 (재료의 표 참조). 1X TE 버퍼 (200)과 96 웰 마이크로 플레이트에서 각 샘플에 희석 된 시약의 55 μl를 추가 dsDNA 정량 시약 1을 희석. 잘 혼합 판 쉐이커를 사용하여 어둠 속에서, 실온에서 2 분 5 동안 품어. 형광을 이용하여 샘플의 형광을 측정표준 형광 파장 (여기 ~ 480 nm의, 방출 ~ 520 ㎚)에 대한 NCE 마이크로 플레이트 리더와 필터. 형광 강도 측정에 대해 플라스미드 농도 범위 플롯. 세균 서스펜션 정량 : 검은 벽과 바닥 96 웰 마이크로 플레이트에서 10 % 트리톤 X-100은 물론 당 5 μl를 분배 (재료의 표 참조). 접시 통에, 각 웰에 세균 현탁액의 50 μl를 추가하고 실온에서 10 분을 품어. 1X TE 버퍼 (200)과 96 웰 마이크로 플레이트에서 각 샘플에 희석 된 시약의 55 μl를 추가 dsDNA 정량 시약 1을 희석. 잘 혼합 판 쉐이커를 사용하여 어둠 속에서, 실온에서 2 분 5 동안 품어. 표준 형광 파장 (여기 ~ 480 nm의, 방출 ~ 520 ㎚)에 대한 형광 마이크로 플레이트 리더 및 필터를 사용하여 샘플의 형광을 측정한다. 세균 DN을 얻으려면농도는 점 1.5.1.4에서 얻어진 차트에 형광 측정 값을 플롯. 세균의 농도를 구하는 Coxiella 게놈 (2.2 FG)의 질량에 의해 DNA 농도를 나눈다. 게놈 등가 / ㎖의 결과를 표현한다. ACCM -2- 크게 성장 결함을 나타내는 취소 돌연변이. 2. 단일 프라이머 식민지 PCR, 시퀀싱 및 주석 참고 : 다음과 같은 프로토콜이 96 샘플의 DNA 증폭을위한, 멀티 채널 피펫은 다음과 같이하는 것이 좋습니다. 트랜스포존 특이 프라이머 (2.3)와 자성 비드 및 DNA 시퀀싱을 이용하여 PCR 제품의 칼럼 정제를 외부 회사에 하청된다. 증폭 프라이머 Coxiell에 트랜스포존의 삽입 부위를 포함하는 PCR 산물을 얻을 반전 탠덤 반복 (ITR), 상류 (100, 200) 기본 쌍 사이의 하이브리드 화하기 위해 설계되어 있는지 확인합니다게놈. 3 PCR 믹스 ㎖ (1X 고음질 버퍼, 200 μM의 dNTPs, 1 μM 증폭 프라이머, 20 U / mL의 높은 충실도 DNA 중합 효소)를 준비하고 얼음에 설정된 96 웰 PCR 플레이트에 웰 당 29 μL 분주. 전송 PCR 믹스 ACCM-2에 고정 단계에서 각각의 돌연변이의 1 μL. 초기 변성과 실행 PCR (98 ° C, 1 분), 20 높은 엄격주기 (98 ° C, 10 초, 50 ℃, 30 초, 72 ° C, 90 초), 30 낮은 엄격주기 (98 ° C, 10 초, 30 ℃, 30 초, 72 ° C, 90 초), 30 높은 엄격주기 (10 초 98 ° C, 50 ° C, 30 초, 72 ° C, 90 초) (72)에서 최종 연장 다음 7 분 동안 C를 °. 트랜스포존 특이 프라이머 자성 비드 및 DNA 서열을 사용하여 PCR 산물을 정제. 50 ° C, 75 ° C, 40 %, 60 %의 GC 함량, 18 및 25의 뉴클레오티드와 어닐 SI 사이의 길이 사이에 포함하여 예측 용융 온도와 트랜스포존 특이 프라이머를 디자인트랜스포존 ITR의 제 염기쌍 상류 TE 증폭 프라이머 혼성화 부위의 하류 및 적어도 100 염기 쌍. 서열 분석 소프트웨어를 사용하여, Coxiella burnetii 493의 NMI의 완전한 게놈 주석로드. 로드 (BLASTN) 시퀀싱 결과를 정렬하고 전위의 위치를 결정하기 위해 "정렬 기준을"기능을 사용합니다. 일치하지 않는 및 / 또는 더블 reads.To가 돌연변이 라이브러리의 채도를 모니터 표시와 돌연변이를 폐기, 같은 사이트에서 여러 트랜스포존 삽입의 발생 기록을 유지. 3. 진핵 세포는 Coxiella 돌연변이 세포 내 성장의 모니터링과 도전 참고 : 멀티 채널 피펫은 다음과 같이하는 것이 좋습니다. 감염은 검은 벽과 평면 투명 바닥 마이크로 플레이트 멸균 96 웰에 3 회 반복 실시 하였다. 와트 GFP (14)을 표현 중량 Coxiella burnetii의로버트 Heinzen에 의해 제공. 항생제의 부재하에 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된, 페놀 레드 (RPMI 배지를 완료)없이 RPMI에 베로 세포 성장. 감염 전날, PBS의 10 ㎖로 합류 또는 하위 합류 세포 배양 플라스크에서 베로 세포를 씻는다. 세포 배양 플라스크를 트립신 EDTA 용액 1 ㎖를 첨가하여 베로 세포를 분리하고, 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 37 ℃에서 3 내지 5 분 동안 배양. 완전한 RPMI 배지 10ml에 재현 탁 세포. 세포를 세어 ml의 당 10 5 세포의 세포 현탁액을 준비합니다. 투명 평면 바닥 블랙 96- 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100 ㎕를 분주한다. RT에서 400 XG에서 5 분 동안 원심 분리 웰의 바닥에 세포 부착을 용이하게하고, 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 37 ℃에서 밤새 배양. 공동을 포함하는 96 웰 플레이트를 해동실온에서 xiella 돌연변이와는 깊은 우물 96 웰 플레이트에 페놀 빨간색과 FBS없이 RPMI 300 μL에 세균 현탁액 150 μl를 희석. 베로 세포를 포함하는 마이크로에서 용지를 제거하고 100 μL / 웰의 희석 Coxiella 돌연변이 체 (100 MOI)를 분배. 양성 대조군 (중량 Coxiella 100과 200의 감염 (MOI)의 다중성에 GFP (14) 표현에 감염된 세포)와 같은 (비 감염된 세포) 제어 우물 A2 및 A3 부정적뿐만 아니라 A1 사용합니다. 에어로졸 – 꽉 원심 분리기 판 홀더를 사용하여 실온에서 400 XG에 10 분 동안 접시를 원심 분리기. 을 100 μL / 웰의 신선 완전한 RPMI 배지로 배지를 박테리아 – 함유 대체 2 시간 동안 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 37 ℃에서 인큐베이션. 표준 형광 파장 (여기 ~ 480 nm의, 방출 ~ 520 ㎚)에 대한 형광 마이크로 플레이트 리더 및 필터를 사용하여 7 일간 GFP의 형광을 매일 측정한다. 피하기 위해간섭 배지에서 응축 및 신호 분산액에, 마이크로 플레이트 리더에 바닥 여기 및 발광을 사용하여 기록 인해. 자동 이미지 획득을위한 샘플 4. 준비 , 절차는 한 96 웰 플레이트입니다 따라 볼륨을 확장 : 참고. 4.2 단계 접시 세척기의 장점을 취할 수있다. 7 일째 게시물 감염에서 판에서 매체를 제거하고 보통 1 적절한 희석 (에서 세포 투과성 형광 염료를 포함 / 잘 신선한, 전체 매체의 50 μL로 교체 : 사용되는 세포주에 따라 최적화 할 수 1,000 ). 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 37 ° C에서 60 분 – 30 세포를 부화. 다음 PFA 함유 버퍼를 제거하고 PBS로 3 회 씻어 실온 (RT)에서 30 분 동안 품어 / 웰의 4 % 파라 포름 알데히드 50 μL PBS에서 (PFA)와 매체를 교체합니다. PBS와 dispens 제거E 50 μL / 웰의 0.05 % 사포닌 보충 된 용액 (0.5 % 소 혈청 알부민, 50 mM의 PBS NH 4 CL, pH를 7.4) 차단. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. 500 희석 : 40 μL / 웰의 (위)을 사포닌 보충 신선한 차단 솔루션과 1에 방지 램프 1 항체로 차단 솔루션을 교체합니다. 실온에서 30 분 동안 접시를 품어. 솔루션을 차단 제거하고 100 μL / PBS 잘으로 96 웰 플레이트를 5 회 반복한다. 분배 40 / 웰 (1 희석 : 1000) (전술 한 바와 같이) 사포닌이 보충 용액, 적절한 형광 표지 된 이차 항체를 차단 μL 단계 4.4에서 적용 항 LAMP1 항체를 나타 내기 위해, 5 μg의에 훽스트 33258 / ㎖. 실온에서 30 분 동안 접시를 품어. 솔루션을 차단 제거하고 100 μL / PBS 잘으로 96 웰 플레이트를 5 회 반복한다. 고정 된 세포가 건조하지 않아야로, 96 웰 플레이트의 마지막 세척에 해당하는 PBS의 볼륨을 남겨주세요. 이미지 후속 분석을 위해 빛으로부터 보호 4 ° C에서 즉시 플레이트 또는 저장 판,. 5. 이미지 수집 표면 형광 자동화 된 현미경을 사용하여 33258 (350 nm의, 숙주 세포 핵), 빨간색 (~ 555 nm의, 세포막 마커)과 멀리 빨간색 (~ 615 nm의, 램프 1) 채널이 장착 된 GFP의 이미지 (488 nm의, 박테리아), 훽스트 획득 20X 목표와. 이미지에 위해 샘플 당 5,000 세포의 최소 아니라 당 21 독립적 인 필드를 취득. 참고로 숙주 세포 핵 채널을 이용하여 오토 포커싱 적용. 세균 병원체가 숙주 세포를 감염 낮은 백분율로 작업 할 때 사용자는 분석하고 500에 감염된 세포의 최소값을 얻기 위해서는, 웰 당 묘화 독립적 필드 수를 조정할 수있다. 6. 이미지 처리 주 : 다음 단계는 이미지 분석 소프트웨어 CellProfiler의 사용을 위해 특정된다. 모든 경우에, 최적 algorit분할에 대한 HM은 실험적으로 정의해야하고 이미지의 테두리를 터치 개체는 해당 기능을 제거해야합니다. CellProfiler에 모든 이미지를로드합니다. 다음 단계에서, 숙주 세포의 핵으로서 (도 훽스트 의해 표시됨) Coxiella 콜로니의 검출을 피하기 위해, 훽스트 채널로부터 GFP 채널을 감산하도록 모듈 "ImageMath"를 사용한다. 단계 6.2의 결과 이미지에서 세그먼트 숙주 세포의 핵에 모듈 "IdentifyPrimaryObjects"를 사용합니다. 분할 된 객체 "핵을"이름을 지정합니다. 씨앗과 같은 단계 6.3에서 검출 된 핵을 사용하여 555 nm의 이미지에서 세그먼트 숙주 세포에 모듈 "IdentifySecondaryObjects"를 사용합니다. 분할 된 객체 "셀"이름을 지정합니다. (선택 사항) 단계 6.4에서 확인 된 세포 단계 6.3에서 확인 된 핵을 뺄 모듈 "IdentifyTertiaryObjects"를 사용합니다. 분할 된 객체의 이름을 "세포질221 ;. 배경을 제거하고 램프 1 양성 구획의 다음과 같은 식별을 용이하게하기 위해 615 nm의 이미지에 모듈 "EnhanceOrSuppressFeatures"를 사용합니다. 램프 1 양성 구획을 식별하는 단계 6.6에서 얻어진 이미지에 모듈 "IdentifyPrimaryObjects"를 사용합니다. 분할 된 객체 "리소좀을"이름을 지정합니다. Coxiella 식민지를 식별하기 위해 488 nm의 이미지에 모듈 "IdentifyPrimaryObjects"를 사용합니다. 분할 된 객체 "식민지"이름을 지정합니다. 씨앗과 같은 단계 6.8에서 검출 된 Coxiella 식민지를 사용 Coxiella 함유 액포를 식별하기 위해 615 nm의 이미지에 모듈 "IdentifySecondaryObjects"를 사용합니다. 분할 된 객체 "CCVS를"이름을 지정합니다. (이미지의 테두리를 터치 세포가 제거 된 바와 같이, 일부 CCVS는 "외부"세포를 검출 될 수있다) 세포에서 감지 CCVS를 선택하는 모듈 "MaskObjects"를 사용합니다. 입술의 이름을ulting는 "필터링 CCVS를"개체. (이미지의 테두리를 터치 세포가 제거 된 바와 같이, 일부 식민지는 "외부"세포를 검출 될 수있다) 세포에서 감지 식민지를 선택하는 모듈 "MaskObjects"를 사용합니다. 결과 객체 "필터링 식민지를"이름을 지정합니다. 세포에 리소좀을 연결하는 모듈 "MaskObjects"를 사용합니다. 결과 객체 "필터링 리소좀을"이름을 지정합니다. Coxiella 식민지를 포함하는 셀을 선택하는 모듈 "MaskObjects"를 사용합니다. 결과 객체 "에 감염된 세포를"이름을 지정합니다. 모듈을 사용하여 부모 객체 "세포"의 자식으로 객체 "필터링 CCVS"로 설정 "개체 연관". 이것은 CCVS / 셀의 수를 카운트 허용 할 것이다. 모듈을 사용하여 부모 객체 "세포"의 자식으로 객체 "필터링 된 식민지"로 설정 "개체 연관". 이 의지콜로니 / 셀의 수를 카운트 할 수 있습니다. 부모 개체 "세포"의 자식으로 객체 "필터링 리소좀을"설정 "개체 연관"모듈을 사용합니다. 이것은 리소좀 / 셀의 수를 카운트 허용 할 것이다. 핵, 세포, 필터링 CCVS, 필터링 식민지 여과 리소좀의 형태 학적 분석을 얻기 위해 모듈 "MeasureObjectSizeShape"를 사용 필터링 CCVS와 관련된 GFP의 형광을 정량화하고 CCVS 내 Coxiella 복제의 효율성을 추정하기 위해 모듈 "MeasureObjectIntensity"를 사용합니다. 모듈 "OverlayOutlines"및 "SaveImages"을 이용하여 분할 결과 및 품질 관리에 대한 원본 이미지를 오버레이. 전부 또는 이미지 분석 결과의 선택을 수출하는 모듈 "ExportToSpreadsheet"를 사용합니다. (선택 사항) 결과를 분석하는 모듈 "ExportToDatabase"를 사용소프트웨어 CellProfiler 분석가를 사용하여. 7. 데이터 분석 각 매개 변수를 얻을 경우, 확인 후 돌연변이 당 평균 값을 계산 (때문에 영상 분할의 오류에) 이상 값을 제거한다. 중요한 표현형을 식별하는 Z-점수를 사용합니다. > Z 점수와 표현형을 고려 -2 비 중요하게, Z-점수 ≤ -4 강한과 -2 -4와 같은 온화하고 표현형 사이의 Z 점수와 표현형. 실험의 필요에 따라 매개 변수의 플롯 조합.
Representative Results
트랜스포존 돌연변이 체의 분리 후, 단일 콜로니 PCR 프라이머는 각 변이체에 대한 트랜스포존 삽입 부위를 식별하기 위해 강력하고 높은 처리량 방법이다. 이 접근법은 전형적인 중첩 PCR 프로토콜에서 유래하지만 여기에 단일 프라이머 어닐링 온도 (도 1a)의 엄격함에 따라 주형 DNA에 특이 적 및 / 또는 비 – 특이 적 혼성화. 전형적인 PCR 제품 고유 대부분 여러 DNA 단편 (도 1b)로 구성된다. 오른쪽 트랜스포존 ITR의 상류 및 증폭 프라이머에 의해 인식 서열의 하류 어닐링 다른 시퀀싱 프라이머의 사용은 시퀀싱 공정 (도 1C)에 대한 특이성을 제공한다. 서열 분석을위한 자동화 된 소프트웨어는 트랜스포존 삽입 (도 1C)의 정확한 위치를 제공 Coxiella 게놈에 얻어진 서열 정렬. 모든 트랜스포존 삽입은 앤 될 수 있습니다Coxiella 게놈 (그림 1D)에 otated. 각 Coxiella 돌연변이 격리 및 저장 중 또는 스크리닝 이전 ACCM -2- axenically 배지에서 증폭된다.이 16 도트 / ICM Coxiella 유전자 (도 2A)에서 38 트랜스포존 돌연변이의 예를 도시한다. Coxiella 돌연변이의 생존력을 평가하기 위해, 무균 성장 곡선은 1.5 (Figurie 2B)에 기재된 세균 농도 분석을 접종 후 7 일간 배양 박테리아를 샘플링하고 적용함으로써 얻어진다. 증폭 된 돌연변이 후 7 일간 중으로 96- 웰 플레이트에서, 상피 세포와 함께 배양한다. 생성 된 모든 Coxiella 돌연변이 GFP 표지 된 세포 내 성장 곡선은 물론, 매 24 시간을 매의 GFP의 형광 강도를 측정하고, 시간의 함수 (도 2C)로 측정 값을 플로팅하여 수득된다. INTR무 세포 성장 곡선 Coxiella 게놈의 모든 트랜스포존 삽입과 관련된 표현형의 정량 분석을 제공한다. 같은 트랜스포존 돌연변이에 대한 질적 정보를 추가하기 위해, 우리는 자동화 된 이미지 수집 및 분석을 선택했다. 이레는 매 4에 기재된 그러한 CellProfiler (넓음 연구소 5. 자동화 된 이미지 분석 소프트웨어에 기재된 자동화 표면 형광 현미경을 이용하여 분석으로 면역을 위해 처리, 고정, 게시물 감염 www.cellprofiler.com를 취득 채널을 처리) 독립적으로 세그먼트 비교 분석 (그림 3)에 대한 개체를 확인했다. 이 숙주 세포의 핵, 세포 윤곽, 리소좀과 Coxiella 식민지 (그림 3 상단 패널)의 식별 및 형태 학적 특성을 수 있습니다. 세포와 리소좀으로 Coxiella 식민지 상호 연계 identificati 수 있습니다에와 (긍정적 램프 1, 그림 3 왼쪽 하단 패널입니다) Coxiella 함유 액포의 특정 형태 학적 분석. 숙주 세포의 윤곽과 Coxiella 식민지를 상호 연계하는 식별 및 감염된 세포의 특정 형태 학적 분석 (그림 3 하단 중앙 패널을) 할 수 있습니다. 마지막으로, 4 채널은 그림과 품질 관리 목적으로 (그림 3 오른쪽 아래 패널)에 대한 병합됩니다. 자동화 된 이미지 분석에서 얻은 정보는 "다중 표현형 산포도"를 얻기 위해 서로에 대해 도시 될 수있다. 예로서, Coxiella 콜로니도 4a (μm의 2)의 평균 면적에 Coxiella (복제 표현형) 및 / 또는 세포 복제에 영향을주는 돌연변이를 확인하기 위해, 세포 (도 4a) 당 콜로니의 수에 대해 플롯 숙주 세포에 침입하는 세균의 용량 (INTERNA사용 효율 표현형). 통계 분석은 경증 (-4 <Z 점수 ≤ -2) 및 중증 (Z 점수 ≤ -4) 표현형에 해당하는 결과 산포도의 영역을 정의하는 데 사용되었다. 돌연변이는 3 주 클러스터에서 관찰되었다 : Coxiella의 결함이있는 세포 내 성장의 결과 돌연변이가 플롯 (그림 4A, 핑크와 레드 도트)의 가장 왼쪽 부분에 그룹화 하였다 세포에서 Coxiella의 국제화에 영향을 돌연변이가 플롯의 하단 부분에 그룹화되었다 (그림 4a는, 빛과 어둠 파란색 점) 그리고 마지막으로, 플롯의 가장 오른쪽 지역에서 녹색 점 (비 상당한 표현형의 결과 돌연변이에 해당 Z 점수> -2). 중요한 것은, 복제에 실패하지만 여전히 숙주 세포에 침입 할 수있는 돌연변이, 세포 핵 (그림 4C, 두 번째 패널) 호스트에 인접한 단일 박테리아, 또는 작은 식민지, 같은 감염 7 일 후에 검출된다. 따라서, Coxiella의 크기 "콜로가 다진 "가 크게 영향을 받게되지만 감염된 세포의 수는 WT Coxiella -infected 세포에 비해 차이가없는 것이다. 반면에, 숙주 세포에 침입 할 Coxiella의 용량에 영향을주는 돌연변이 콜로니 / 셀의 수의 감소를 초래한다. 이 값이 1보다 크게 될 때, 평균적으로, 감염된 세포의 총 수가 감소가 있음을 나타낸다. 대안 적으로, Coxiella 콜로니 (μm의 2)의 평균 면적은 Coxiella (세포 독성 표현형)에 세포 독성을 부여하는 돌연변이를 식별 감염 (도 4b)에 생존하는 숙주 세포의 수에 대해 도시 될 수있다. 상기와 같이, 통계 분석은 가벼운 (-4 <Z 점수 ≤ -2) 및 중증 (Z 점수 ≤ -4) 표현형에 해당하는 결과 산포도에서 영역을 정의하는 데 사용되었다. 대부분의 돌연변이가 크게 숙주 박테리아 내에서 복제에 관계없이, 세포 생존에 영향을 미치지 않았다 스크리닝세포 (그림 3B 녹색 점). (37) 돌연변이 약간 영향을받는 숙주 세포의 생존 (그림 3B, 밝은 적색 점), 7 돌연변이는 세포 생존 (그림 3B, 어두운 붉은 점) 호스트 특히 해로운했다. 실험의 필요에 따라, 자동 화상 분석 방법에 의해 얻어진 부가적인 파라미터가 다른 차트를 유도하는데 이용 될 수 있습니다. 그림 1. 시퀀싱 및 Coxiella 트랜스포존 돌연변이 주석 (A) 단일 콜로니 PCR 프라이머는 트랜스포존 삽입 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭하기 위해 사용된다. 증폭 프라이머 (앰프)를 어닐링 온도의 엄격도에 따라 특정 및 불특정 프라이머 모두를 사용한다. (B) 하나의 프라이머 식민지 PCR의 전형적인 결과. 각각의를 ReactiON은 트랜스포존 삽입 부위를 포함하는 일부는 가변 크기의 단편의 개수를 생성한다; 일부 다른 무작위 부산물 낮은 엄격 PCR 사이클로 증폭된다. (C) 트랜스 포슨 서열에 혼성화 시퀀싱 프라이머 (서열)의 사용은 관심의 단편의 서열 분석을 허용한다. (D) 서열 분석 소프트웨어는 세균 게놈에 트랜스포존 삽입의 자동 주석을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2. 무균 및 Coxiella 트랜스포존 돌연변이 체의 세포 성장 (A)의 파일럿 화면에서, 우리는 16 코어 38 g 트랜스포존 돌연변이 염기 서열을 단리시키고, 스크리닝 한Coxiella 점 / ICM 분비 시스템의 ENES는 (빨간색 표시). 각 트랜스포존 돌연변이의 생존력을 평가하기 위해, (B), 각각의 성장은 무균 배지에서 분리가이 형광 DNA에 인터 에이전트를 이용하여 태그 팔일 통해 모니터링된다. (C) 각 돌연변이 후 상피 세포를 감염시키기 위해 사용된다. 트랜스포존은 GFP 카세트를 가지고로서, 세포 내 세균의 성장은 마이크로 플레이트 리더를 사용하여, Coxiella 복제와 관련된 GFP의 형광의 변화에 따라 감염의 7 일 이상을 모니터링합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3 : Coxiella 감염의 자동화 된 이미지 분석 자동.메이트 표면 형광 현미경 이미지를 삼중으로 96 웰 플레이트의 웰 당 21의 위치를 사용한다. 이미지 분석 소프트웨어 세그먼트 정량 분석을 위해 각 채널에서 오브젝트를 취득. 모든 경우에, 이미지의 경계를 터치 물체는 제외된다. (A) 훽스트 채널 (녹색 동그라미) 숙주 세포의 핵을 식별하는 데 사용된다. (B) 이들 채널을 Cy3에서 숙주 세포의 윤곽을 파악하기 위해 시드로서 사용되는이 (핵의 위치를 파란색으로 선회되어, 셀 등고선은 녹색이다). (C) Cy5의 채널 LAMP1 양성 구획을 식별하는 데 사용된다 (녹색 원); 만 (빨간색) 이전에 확인 된 세포 윤곽에 포함 된 객체는 이미지 분석을 위해 유지됩니다. (D) 채널은 GFP (녹색 동그라미) Coxiella 콜로니를 식별하는 데 사용된다. (E)는 램프 1 양성 구획으로 Coxiella 식민지 상호 연계하는 것은 Coxiella의 식별을 할 수 있습니다 </em> 함유 액포 (CCVS); 만 (녹색) 이전에 확인 된 세포 윤곽에 포함 된 객체는 이미지 분석을 위해 유지됩니다. 세포 윤곽으로 Coxiella 식민지의 상관 관계 (F)는 감염된 세포 (모조 착색)의 식별을 할 수 있습니다. 4 형광 채널에서 획득 한 (G) 사진 (Coxiella 콜로니 (녹색), 숙주 세포의 핵 (파란색), 숙주 세포의 원형질막 (회색) LAMP1 양성 구획 (적색)에 대응하는) 병합 및 그림 품질을 위해 사용된다 제어 할 수 있습니다. 규모는 10 μm의 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 4 : 호스트에 관여 Coxiella 인자 대규모 성분 / 병원균 인터랙트이온. (A) Coxiella 콜로니 (2 μm의) 세포 당 콜로니의 상대적인 수에 대해 플롯 팅 평균 면적은, 관심 복제 및 내재화 표현형 동정을 행 하였다. 녹색 점은 Z 점수> -2 (중요하지 않음)에 의해 WT Coxiella에서 벗어나는 표현형을 나타낸다. 핑크와 밝은 파란색 점 -2 -4 (가벼운 표현형) 사이의 Z 점수로, 각각 복제 및 내재화 표현형을 나타냅니다. 빨간색과 진한 파란색 점은 Z-점수 ≤ -4 (강한 표현형)과 표현형을 나타냅니다. Coxiella 콜로니 (B) (2 μm의) 평균 면적은 트랜스포존의 삽입에 의한 세포 독성 효과를 추정하기 위해 감염 후 7 일 살아남은 세포 (감염과 감염되지 않은)의 총 수에 대해 도시 하였다. 녹색 점은 Z 점수> -2 (중요하지 않음)에 의해 WT Coxiella에서 벗어나는 표현형을 나타낸다. 핑크 도트는 세포 독성 산도를 나타내는-2 -4 (가벼운 표현형) 사이의 Z-점수 enotypes. 빨간 점은 Z-점수 ≤ -4 (강한 표현형)와 세포 독성 표현형을 나타냅니다. 화살표 (C) (C)에 대응하는 소문자에 의해 설명 돌연변이 복제, 국제화 및 세포 독성 표현형의 대표 이미지를 나타냅니다. 모든 경우에있어서, 숙주 세포의 핵이 적색이고, Coxiella 콜로니는 녹색이다. 규모는 50 μm의 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
호스트 / 병원균 상호 작용의 연구는 세균 감염을 이해하고 전염성 질환에 대응하기 위해 대체 전략을 개발하는 놀라운 방법이 될 입증되었습니다. 그러나, 다른 병원성 세균에 의해 정교 전략의 다양성, 박테리아 독성 인자의 감염시 타겟팅 신호 경로 호스트의 식별 및 특성은 실제 도전을 나타낸다. 이것은 키 호스트 / 병원균 작용 허브 대규모 식별 새로운 접근법의 개발을 요구한다. 혁신적인, 높은 처리량과 높은 콘텐츠 스크리닝 기법의 최근의 개발은 세포 내 박테리아 병원균 (15)의 연구에 적용 할 수있는 귀중한 자원을 나타낸다. 여기서는 트랜스포존 돌연변이 유발 및 형광 계 분석을 결합 스크리닝 방법을 개발하는 모델로 인수 공통 세균성 병원체 Coxiella burnetii에 사용 하였다. ImportanTLY이 스크리닝 방법은, 침략 복제하고 감염된 세포 내에서 유지하기 위해이 세균에 의해 개발 된 전략 개요를 제공하는 글로벌, Coxiella 세포주기의 여러 단계의 동시 모니터링을 허용한다.
여기에 설명 된 접근법을 성공적 세균성 병원균의 연구에 적용되어 두 개의 잘 확립 된 기법, 트랜스포존 돌연변이 유발 및 형광 계 분석에 기초한다. 높은 처리량 / 높은 컨텐츠 화면의 문맥에서 이들 기술을 조합하면 우리는 이벤트의 매우 높은 번호 (세균의 돌연변이 당 전형적으로 15,000 감염된 세포 영상화 및 분석한다)를 분석함으로써 세균의 돌연변이 높은 수의 효과를 평가할 수있다. 이것은, 자연, 높은 변동 될 수 있습니다 숙주 세포 및 세포 내 복제의 세균 침입으로 사건의 중요한 통계 분석을 제공합니다. 이 EP 이외의 해당 셀 라인을 주목하는 것이 중요하다ithelial은이 유형의 스크리닝에 사용될 수있다. 숙주 세포 소기관 감지하기 쉽다 그러나, 편평 상피 세포 및 대형 이미지 분석을 위해 최적이다. 자동화 현미경의 대부분이 자동 판의 다수를 처리 할 수 있기 때문에, 동시에 스크리닝 할 수있는 돌연변이의 수를 실질적으로 제한이 없다. 병원체에 따라 사용자 캔 특권 또는 표면 형광 공 초점 현미경의 사용. 화상 취득의 시간은 주로 웰 당 시야 당 획득 채널 수에 취득 된 필드의 수에, 현미경 카메라의 감도에 의존 할 것이다. 사용자는 선별 프로토콜을 최적화하기 위해 이러한 인자를 조절하는 방법을 결정할 수있다. 예로서, 우리는 5.1 포인트로 지시 한 조건을 이용하여 96 웰 플레이트 / 시간을 묘화. 이미지 분석은 주로 사용되는 기계 (또는 기계 클러스터)에 따라 달라집니다. 우리는 12 코어 (2 × 3.06 GHz의 6 코어) 48 기가 바이트 RAM의 워크 스테이션을 사용합니다. 이 기계는 approxi이 필요합니다후면부로 40 분 한 판에서 획득 된 영상을 분석합니다.
이러한 분석법을 개발하는 새로운 세트 업 (또는 기존의 최적화) 샘플들의 다수의 조작 및 처리를 허용하는 프로토콜 인 경우 중요한 측면이 고려되어야한다. 전형적인 예는 우리가 급속 증폭을 허용 단일 콜로니 PCR 프라이머 접근법의 개발은 매우 작은 샘플들로부터, 각각의 트랜스포존의 삽입 위치를 포함하는 서열 Coxiella DNA 단편. 우리의 경험에 기초하여, 고성능 폴리머 엄선하고 재현 가능한 결과를 수득하기 위해 테스트되어야한다. 이 방법의 유일한 제한은, 대부분의 경우에, 처리 된 샘플의 약 30 %가 악용되지 않으며, 관측 PCR 또는 서열 분석에 의한 단계를 숨길 수있다. 그러나, 새로운 Coxiella 트랜스포존 돌연변이 체의 분리가 속도 – 제한 단계가 아님을 고려하면, 이는 파트 : 않는다주요 문제를 보냈습니다. 마찬가지로, 돌연변이 주식의 세균 농도를 정량화 할 수있는 신뢰할 수있는 분석의 개발이 방법의 핵심이었다. 서스펜션의 집계 Coxiella의 경향으로 인해, 광학 밀도 수치를 사용했다 Coxiella의 문화와 만 기존 대안의 농도 정량 PCR (qPCR에)을 계산하기 위해 적용 할 수 없습니다. 여기서, 형광 태그 DNA에 인터 제의 사용은 크게 박테리아 정량을 가속화.
이 접근법은 또한 사용될 병원체에 따라 여러 가지 세포 내 구획 용 형광 마커를 발현하는 안정한 세포주의 사용을 활용할 수있다. 또 다른 중요한 측면은 페놀 레드없는 세포 배양 배지의 사용이다. 우리는이 산도 표시등이 자동 형광 판독기에 기록 된 신호를 포화 빨간색과 녹색 스펙트럼에 걸쳐 자연 형광을 가지고 관찰했다.
티그는 여기에 제시된 전략은 임의 트랜스포존 돌연변이 유발에 의존한다. 관심의 돌연변이를 들어, 우리는 남부 얼룩과 트랜스포존 삽입 부위의 PCR의 증폭을 사용하여 고유의 트랜스 포지션의 유효성을 검사 (및 clonality) 좋습니다.
프로토콜 절에 설명 된 장치 외에, 여기에 제시된 스크리닝 방법을 사용하고자 팀, 데이터 수집, 데이터 저장을위한 서버 및 신속한 화상 분석 워크 스테이션 관계형 데이터베이스의 셋업에서 큰 장점을 취할 것이다.
중요한 것은, 여기에 다른 세포 내 세균 병원균의 연구를 위해 적합하다 기재된 방법은 무작위 돌연변이 유발 법은 병원체 존재 제공 세포주 병원체에 의해 감염 될 수 있으며,이 중 하나는 감염시 특정 표현형을 표시한다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N° 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.
Materials
| Citric acid | Sigma | C0759-500G | ACCM-2 medium component |
| Sodium citrate | Sigma | S4641-500G | ACCM-2 medium component |
| Potassium phosphate | Sigma | 60218-100G | ACCM-2 medium component |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670-100G | ACCM-2 medium component |
| Calcium chloride | Sigma | C5080-500G | ACCM-2 medium component |
| Iron sulfate | Sigma | F8633-250G | ACCM-2 medium component |
| Sodium chloride | Sigma | S9625-500G | ACCM-2 medium component |
| L-cysteine | Sigma | C6852-25G | ACCM-2 medium component |
| Bacto Neopeptone | BD (Beckton-Dickinson) | 211681 | ACCM-2 medium component |
| Casamino acids | BD (Beckton-Dickinson) | 223050 | ACCM-2 medium component |
| Methyl-B-Cyclodextrin | Sigma | C4555-10G | ACCM-2 medium component |
| RPMI w/glutamax | Gibco | 61870-010 | ACCM-2 medium component |
| RPMI w/glutamax, without phenol red | Gibco | 32404-014 | For cell culture and infection |
| Fetal Bovine Serum | GE healthcare | SH30071 | For cell culture |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | For cell culture |
| Saponin | Sigma | 47036 | For immunofluorescence staining |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | For immunofluorescence staining |
| Bovine Serum Albumine | Sigma | A2153 | For immunofluorescence staining |
| Electroporation cuvette 0.1 cm | Eurogentec | ce0001-50 | For Coxiella transformation |
| Trackmates screw top tubes with caps | Thermo Scientific | 3741 | 2D barcoded screwcap |
| 96-well microplate with black walls and bottom | Greiner | 655076 | Flat dark bottom, for dsDNA quantitation |
| 96-well microplate, ��clear, black walls | Greiner | 655090 | Flat transparent bottom, for cell culture and imaging |
| 96-well PCR microplate | Biorad | 2239441 | DNAse/RNAse free |
| 96-well plate, Deepwell | Labcon | 949481 | For Coxiella mutants infections |
| PicoGreen | Life Technologies | P7581 | For dsDNA quantitation |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | For dsDNA quantitation |
| Phusion High fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | For single primer colony PCR |
| Celltracker Red CMTPX | Life Technologies | C34552 | For imaging |
| Anti-LAMP1 antibody | Sigma | 94403-1ML | For immunofluorescence staining |
| Hoechst 33258 | Sigma | L1418 | For imaging |
| Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro | Tecan | ||
| Epifluorescence automated microscope Cellomics | Thermo Scientific |
References
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Citer Cet Article
Martinez, E., Cantet, F., Bonazzi, M. Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants. J. Vis. Exp. (99), e52851, doi:10.3791/52851 (2015).