発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em> Q熱リケッチア</em>トランスポゾン変異体

GFPタグコクシエラトランスポゾン変異体のライブラリーの1世代ローカルルールに準拠して、微生物安全キャビネット（MSC）にバイオセイフティ封じ込めレベル2（BSL-2）でコクシエラバーネッティ RSA439 NMIIを操作します。使用細菌のモデルと互換性場合、クローン変異体を得る確率を高めるために1.4.1から1.4.4への手順を繰り返します。典型的な変異体のライブラリーを使用し、生物のゲノムに注釈付きコード配列の3倍の数に等しい変異体の数の（少なくとも）で構成されています。 エレクトロコクシエラRSA439 NMIIの調製： 13.4 mMのクエン酸、16.1 mMのクエン酸ナトリウム、3.67 mMリン酸カリウム、1mMの塩化マグネシウム、0.02mMの塩化カルシウム、0.01mMの硫酸鉄、125.4 mM塩化ナトリウム、1.5mMのL-システイン0.1 G：1X ACCM-2 13を準備します/ Lバクトネオペプトン、2.5グラム/ Lカザミノ酸、を1g / Lのメチルβシクロデキストリン125ミリリットル/ L RPMI。 4.75とフィルター滅菌し（オートクレーブしない）にpHを調整します。注：液体ACCM-2は、約1ヶ月間、4℃で安定です。 -80℃のストックから（以前にステップ1.5のように生成し、定量細菌ストックから） コクシエラ RSA439 NMIIの2×10 6ゲノム当量（GE）/ mlのACCM-2の100ミリリットルに接種し、75で細菌懸濁液を配布（ -フラスコ当たりの細菌懸濁液の15 mlの10）通気キャップ付きcm 2の細胞培養フラスコ。 5％CO 2、2.5％O 2の加湿雰囲気中、37℃で7日間増殖。 プール4°Cで1時間3,900×gで50ミリリットルチューブおよび遠心機で得られた細菌懸濁液。 上清を捨て、10％グリセロール30mlにペレットを再懸濁します。 4°Cで1時間3,900×gで遠心分離します。 10％グリセロール（典型的には2 ml）および500μlのアリコートをチューブ中の50μlの適切な量でペレットを再懸濁します。再懸濁したBを保ちます全体のプロセスの間に氷上でacteria。注：この段階では、細菌は、エレクトロであり、1つのアリコートは、一エレクトロポレーションを行うのに十分です。細菌懸濁液を、6ヶ月間-80℃で保存することができ、または直接のプラスミドDNAのエレクトロポレーションのために使用することができます。 transposon-とトランスポザーゼをコードするプラスミドで有能コクシエラのエレクトロポレーション： 注：以下のプロトコルのために、転移因子およびトランスポザーゼは（それぞれ、PITR-CAT-GFPとのpUC19-Himar1C9）二つの異なるプラスミドによりコードされている7。両方のプラスミドは、コクシエラでエレクトロときにそれら自殺プラスミド作り、コクシエラ固有の複製起点を欠いています。これは、安定したトランスポゾン挿入を保証します。転移因子は、選択のためのコクシエラプロモーターp1169とGFPと生成された変異体をタグ付けするコクシエラプロモーターP311の調節下にGFP遺伝子の調節下にクロラムフェニコール耐性カセットを含みます。 PR氷上で10分間、0.1センチエレクトロポレーションキュベットを電子冷却。 10μgのトランスポゾンプラスミドおよびトランスポザーゼプラスミド710μgのエレクトロコクシエラ 50μlのを混ぜます。そのプラスミド濃度はグリセロールの希釈を最小限にするよりも高い500 / mlのあることを確認してください。 次のセットアップを使用して、エレクトロポレーション：18 kVで、500Ω、25μF。得られた時定数は9と13ミリ秒の間に含まれていることを確認。 すぐに、RPMIの950μlを添加する電気穿孔細菌を再懸濁し、スクリューキャップチューブに移し、室温で保管してください。 エレクトロポレーション、細菌の200μLを取り、6ウェルプレートに1％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を補充したACCM-2の3ミリリットルに追加。エレクトロポレーション、細菌の残量にDMSOを88μl加え、-80℃で、店舗（10％DMSOの最終濃度に達するまで）。 トランスポゾン突然変異体の選択。 Incuba5％CO 2、2.5％O 2の加湿雰囲気中で37℃で一晩（1.2.4）上記のように接種した6ウェルプレートTE。適切な抗生物質（375 / mlのカナマイシン、3 / mlのクロラムフェニコール）を追加します。上記の条件でさらに3日間細菌培養物をインキュベートします。 個々の変異体の単離： コクシエラトランスポゾン変異体の固体ACCM-2のプレートの作製とめっき注：以下の手順は、1ペトリ皿のために、細菌培養物のいくつかの希釈は、コロニーを単離するための最適な接種量を評価するためにテストする必要があります。 電子レンジで0.5％アガロース10.5 mlで加熱し、55℃の水浴中で冷まします。 37℃で2×ACCM-2（pHは4.75）11.25 mlで加熱します。 底部アガロースを準備します。 2X ACCM-2 10mlで溶融し、0.5％アガロースを10mlを混合し、適切な抗生物質（375 / mlのカナマイシン又は3を追加/ mlのクロラムフェニコール）。 ペトリ皿にすぐに注ぎます。ペトリ皿unliddedを維持し、20分間、30分間、空気乾燥するための媒体を涼しくしましょう​​。 トップアガロースを準備します。 適切な抗生物質（375 / mlのカナマイシン、3 / mlのクロラムフェニコール）を追加し、37℃でインキュベート5mlのポリスチレンチューブ内の水の0.75ミリリットルで2回ACCM-2の1.25ミリリットルを混ぜます。 5秒間細菌培養（典型的には1〜100μL）と渦を追加します。 、溶融アガロース0.5 mlを加え混ぜ、すぐに底アガロースに注ぎます。 、20分間冷却ペトリ皿に蓋を交換し、アガロース凝固を促進するために、4℃で20分間インキュベートすることができます。 MSCにunlidded 20分間空気乾燥。 6~7日間、5％CO 2および2.5％O 2の加湿雰囲気中、37℃でプレートを成長します。 残りの細菌にDMSOを追加-80℃で10％のDMSO、店舗の最終濃度を達成するために、L培養。 次のように最適希釈を評価：コロニーは直径0.5〜1ミリメートルであり、適切に交差汚染を避けるために隔離されていることを確認してください。 1.4.1.2と1.4.1.3で説明したようにACCM-2寒天上の適切な希釈でポイント1.4.2およびプレートから残りの細菌培養物を解凍します。 1.4.1.3.5に記載されているように6〜7日間インキュベートします。 コロニーが検出されたら、/適切な抗生物質（375 / mlのカナマイシンまたは3μgのを含むACCM-2の1.5ミリリットルで、1ミリリットルチップの先端を切断分離されたコロニーを含むプラグをピッキングし、ピペッティングによりコロニーを分散させることによってそれらを収集24ウェルプレート中のmlのクロラムフェニコール）。 1.3.1に記載した条件で6日間、個々のコロニーを増幅します。インキュベーションの3日目に、それぞれの文化をピペットで細菌塊を分散させます。 10で96ウェルプレート中の2Dバーコードスクリューキャップチューブ中の各変異体の懸濁液を保存します-80℃での％のDMSO。 細菌濃度の評価： 注：以下の手順は、無菌媒体に複製する細菌の突然変異体（1.4.4を参照）の成長曲線を得るために適用することができます。 標準曲線の準備： 二本鎖DNAを2μg/ mlのストック溶液を1×トリスEDTA（TE）中の（既知のサイズと濃度の典型的ランダムプラスミド）を準備します。 2 / mlのから2 ngの/ mlの範囲の濃度を得るために、原液から10倍連続希釈液を調製します。 （ 材料の表を参照）、黒壁や底部を有する96ウェルマイクロプレートの単一ウェルに各濃度の50μLを分注します。 1×TE緩衝液に200と96ウェルマイクロプレートに各サンプルに希釈された試薬の55μlを添加する：二本鎖DNAの定量試薬1を希釈します。プレートシェーカーを用いて十分に混合し、暗所で、室温で2〜5分間インキュベートします。 蛍光を発するを使用したサンプルの蛍光を測定標準的なフルオレセインの波長（励起〜480nmで、発光〜520 nm）のためのNCEマイクロプレートリーダーおよびフィルタ。 蛍光強度の測定値に対するプラスミド濃度範囲をプロットします。 細菌懸濁液の定量： 黒壁と底面（ 材料の表を参照のこと）で96ウェルマイクロプレートにウェルあたり10％トリトンX-100の5μLを分注します。プレートシェーカー上で、各ウェルに細菌懸濁液の50μLを加え、室温で10分間インキュベートします。 1×TE緩衝液に200と96ウェルマイクロプレートに各サンプルに希釈された試薬の55μlを添加する：二本鎖DNAの定量試薬1を希釈します。プレートシェーカーを用いて十分に混合し、暗所で、室温で2〜5分間インキュベートします。 標準的なフルオレセインの波長（励起〜480nmで、発光〜520 nm）のための蛍光マイクロプレートリーダーおよびフィルタを使用して、サンプルの蛍光を測定します。 細菌DNを取得するには濃度は、点1.5.1.4で得られたチャートの蛍光測定値をプロットします。細菌の濃度を得るために、 コクシエラゲノム （2.2 FG）の質量によってDNA濃度を分割します。ゲノム当量/ mlの中で結果を表現します。 ACCM-2での大きな成長欠陥を示す変異体を捨てます。 2.単一のプライマーコロニーPCR、シーケンシング、および注釈注：以下のプロトコルは、96サンプルのDNA増幅のためのものである、マルチチャンネルピペットは、次の手順をお勧めします。トランスポゾン特異的プライマー（2.3）を有する磁気ビーズ及びDNA配列決定を使用して、PCR産物をカラム精製は、外部の会社に委託されています。 増幅プライマーはCoxiellにトランスポゾン挿入部位をカバーするPCR産物を得るために、反転タンデムリピート（ITR）の上流100および200塩基対の間にハイブリダイズするように設計されていることを確認ゲノム。 3 PCRミックスのミリリットル（1×高忠実度緩衝液、200μMのdNTPを、1μMの増幅プライマー、20 U / mlの高忠実度DNAポリメラーゼ）を準備し、氷の上に設定され、96ウェルPCRプレートにウェルあたり29μLを分注します。 PCRミックスへの転送ACCM-2における固定相の各変異体の1μLを。 最初の変性で実行PCR（98°C、1分）、20高ストサイクル（98°C、10秒; 50℃、30秒; 72℃、90秒）、30低ストサイクル（98°C、 10秒; 30℃、30秒; 72℃、90秒）、30高ストサイクル（98°C、10秒; 50℃、30秒; 72℃、90秒）72での最終伸長によって実施されました7分間°C。 トランスポゾン特異的プライマーを用いて、磁気ビーズおよび配列DNAを用いてPCR産物を精製します。 50°Cと75°C、40％、60％、18から25ヌクレオチドの間の長さおよびアニーリングSiのGC含量との間に含まれる予測融解温度を有するトランスポゾン特異的プライマーを設計トランスポゾンITRの最初の塩基対の上流TE増幅プライマーのハイブリダイゼーション部位の下流に少なくとも100塩基対。 配列解析ソフトウェアを使用して、Q熱リケッチア493 NMIの完全な、注釈付きのゲノムをロードします。ロードして（BLASTN）配列決定の結果を合わせ、転位の部位を決定するために、「位置合わせ基準に "関数を使用します。非マッチングおよび/または二重reads.Toは変異体ライブラリーの飽和を監視表示を有する変異体を捨て、同じサイトに複数のトランスポゾン挿入の発生を記録しておきます。 3.真核細胞コクシエラ変異体と細胞内増殖のモニタリングとチャレンジ注：マルチチャンネルピペットは、次の手順をお勧めします。感染症は、黒壁や平らな透明底部を有するマイクロ滅菌96ウェル中で三連で行いました。 GFP 14ワットを表現重量Q熱リケッチアロバートHeinzenによって提供されます。 （RPMI培地を完了）、抗生物質の非存在下で、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したフェノールレッドを含まないRPMI中でVero細胞を成長させます。 感染の前日には、PBS 10mlでコンフルエントまたはサブコンフルエント細胞培養フラスコからVero細胞を洗浄します。 細胞培養フラスコにトリプシンEDTA溶液1mlを添加することによって、ベロ細胞を剥離し、5％CO 2の加湿雰囲気中、37℃で3〜5分間インキュベートします。 完全RPMI培地10ml中の細胞を再懸濁し。細胞をカウントし、1mlあたり10 5細胞の細胞懸濁液を準備します。 平坦な透明底部を有する黒色96ウェルプレートの各ウェルに100μlの細胞懸濁液を分注します。 室温で400×gで5分間遠心分離し、ウェルの底部での細胞接着を促進し、5％CO 2の加湿雰囲気中で37℃で一晩インキュベートします。 Coを含む96ウェルプレートを解凍RTでxiella変異体とは、深い96ウェルプレートにフェノールレッド及びFBSを含まないRPMI300μlの中の細菌懸濁液150μLを希釈します。 Vero細胞を含むマイクロプレートから培地を除去し、100μl/ウェルの希釈コクシエラ変異体（100のMOI）を分注します。 （100と200の重量コクシエラに感染した細胞は、感染の多重度でGFP を発現している14（MOI））を陽性対照として陰性（非感染細胞）コントロール、ウェルA2およびA3とA1をよく使用します。 エアロゾルタイト遠心プレートホルダーを使用して、室温で400×gで10分間プレートを遠心。 その後、100μl/ウェルの新鮮な完全RPMI培地で細菌を含む培地を交換して2時間5％CO 2の加湿雰囲気中で37℃でインキュベートします。 標準的なフルオレセインの波長（励起〜480nmで、発光〜520 nm）のための蛍光マイクロプレートリーダーとフィルタを使用して、7日間のGFP蛍光を毎日測定します。回避するために、干渉培地中で凝縮及び信号分散液に、マイクロプレートリーダーで底励起および発光記録を使用するため。 自動画像取得のための試料の調製4。 注：手順は、1枚の96ウェルプレートのためであり、それに応じてボリュームをスケールアップ。 4.2からのステップは、プレートウォッシャーを利用することができます。 日の感染後第 7に、プレートから培地を除去し、50μL/ウェルの適切な希釈（通常1で細胞透過性蛍光色素を含有する新鮮な、完全培地に置き換え：1,000、使用する細胞株に応じて最適化することが可能に）。 5％CO 2の加湿雰囲気中で37℃で60分間- 30細胞をインキュベートします。 、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）を50μl/ウエルで培地を交換し、室温（RT）で30分間インキュベートし、次いでPFAを含有する緩衝液を除去し、PBSで3回洗浄します。 PBSおよびdispensを削除Eを50μl/ウェルの0.05％サポニンで補充液（0.5％ウシ血清アルブミン、PBS、pH7.4中の50mM NH 4 Clで）をブロックします。室温で30分間インキュベートします。 ：500希釈の40μl/ウェルの（上記）サポニンとし、1で抗LAMP1抗体を補充した新鮮なブロッキング溶液でブロッキング液を交換してください。室温で30分間静置します。 ブロッキング溶液を削除し、100μlのPBS /ウェルで96ウェルプレートを5回洗浄します。 5μgのでステップ4.4で適用される抗LAMP1抗体を明らかにし、ヘキスト33258で：40μL/ウェル（上記）サポニンを補った溶液、（千1の希釈で）適切な蛍光標識した二次抗体をブロックするのを分配/ mlです。室温で30分間静置します。 ブロッキング溶液を削除し、100μlのPBS /ウェルで96ウェルプレートを5回洗浄します。固定された細胞が乾燥しないでくださいように、96ウェルプレート内の最後の洗浄に対応するPBSの体積を残します。 画像その後の分析のため、光から保護し、4℃で直ちにプレートまたはストアプレート、。 5.画像取得装備落射蛍光自動顕微鏡を用いてGFP（488nmで、細菌）、ヘキスト33258（350nmで、宿主細胞核）、赤（〜555nmで、細胞膜マーカー）および遠赤色（〜615ナノメートル、LAMP1）チャンネルの画像を取得20Xを目的としました。画像化するために、サンプルあたり5,000個の細胞の最小値を、ウェル当たり21の独立したフィールドを取得します。参照として、宿主細胞核チャネルを使用してオートフォーカスを適用します。細菌性病原体は、宿主細胞の低い割合に感染して作業する場合、ユーザーが分析するために500に感染した細胞の最小値を得るために、ウェルあたり撮像された独立したフィールドの数を調整することができます。 6.画像処理注：次の手順は、画像解析ソフトウェアCellProfilerの使用に特異的です。すべての場合において、最適なalgoritセグメント化のためのHMは、実験的に定義する必要があり、画像の境界に触れるオブジェクトは、適切な機能を排除する必要があります。 CellProfiler内のすべての画像をロードします。 次の手順で、宿主細胞核として（もヘキストによって標識） コクシエラコロニーの検出を回避するために、ヘキストチャネルからGFPチャネルを減算するモジュール「ImageMath "を使用します。 ステップ6.2の結果として得られる画像からセグメント宿主細胞核にモジュール「IdentifyPrimaryObjects」を使用してください。セグメント化されたオブジェクトの「核」という名前を付けます。 シードとしてステップ6.3で検出された核を使用して、555nmの画像からセグメントの宿主細胞へのモジュール「IdentifySecondaryObjects」を使用してください。セグメント化されたオブジェクトの「セル」という名前を付けます。 （オプション）ステップ6.4で同定された細胞から、ステップ6.3で特定された核を減算するモジュール「IdentifyTertiaryObjects "を使用します。セグメント化されたオブジェクトに名前を付け、「細胞質221 ;. 背景を削除し、LAMP1陽性区画の次の識別を容易にするために、615 nmの画像上のモジュール「EnhanceOrSuppressFeatures」を使用してください。 LAMP1陽性区画を識別するためにステップ6.6で得られた画像上のモジュール「IdentifyPrimaryObjects」を使用してください。セグメント化されたオブジェクト「リソソーム」という名前を付けます。 コクシエラコロニーを識別するために、488 nmの画像上のモジュール「IdentifyPrimaryObjects」を使用してください。セグメント化されたオブジェクトの「コロニー」という名前を付けます。 シードとしてステップ6.8で検出コクシエラコロニーを使用して、コクシエラ含有液胞を識別するために、615 nmの画像上のモジュール「IdentifySecondaryObjects」を使用してください。セグメント化されたオブジェクト「CCVS」という名前を付けます。 細胞上で検出CCVSを選択するために、モジュール「MaskObjects」を使用します（画像の境界に触れる細胞が除去されているように、いくつかのCCVSは「外側」の細胞を検出することができます）。解像度に名前を付けますultingは「フィルタ処理CCVSを "オブジェクト。 （画像の境界に触れる細胞が排除されているように、いくつかのコロニーを「外側」の細胞を検出することができる）の細胞で検出されたコロニーを選択するにはモジュール「MaskObjects」を使用してください。結果のオブジェクト "フィルタ済みコロニー」という名前を付けます。 細胞にリソソームを関連付けるために、モジュール「MaskObjects "を使用します。結果のオブジェクト "フィルタ済みリソソーム」という名前を付けます。 コクシエラコロニーを含有する細胞を選択するために、モジュール「MaskObjects」を使用してください。結果のオブジェクト「感染細胞」という名前を付けます。 「オブジェクトを関連付ける "オブジェクトを親オブジェクト「セル」の子として「フィルタさCCVS」を設定するには、モジュールを使用してください。これはCCVS /セルの数をカウントできるようになります。 モジュールを使用して親オブジェクト「セル」の子としてオブジェクト」フィルタを適用したコロニーを「設定する」オブジェクトを関連付けます」。この意志コロニー/セルの数をカウントすることができます。 親オブジェクト「セル」の子としてオブジェクト「フィルタ済みリソソーム "に設定するには、「オブジェクトを関連付ける」モジュールを使用してください。これは、リソソーム/セルの数をカウントすることを可能にします。 核、細胞ろ過CCVS、濾過したコロニーそして濾過リソソームの形態素解析を得るために、モジュール「MeasureObjectSizeShape "を使用してくださいフィルタ済みCCVSに関連するGFP蛍光を定量化し、CCVS内コクシエラ複製の効率を推定するために、モジュール「MeasureObjectIntensity "を使用します。 モジュール「OverlayOutlines」と「SaveImages」を使用して分割結果と品質管理のため、元の画像を重ねます。 全部または画像解析結果の選択をエクスポートするモジュール「ExportToSpreadsheet "を使用します。 （オプション）結果を分析する「ExportToDatabase」モジュールを使用しますソフトウェアCellProfilerアナリストを使用して。 7.データ解析得られた各パラメータについて、次に変異体あたりの平均値を計算する（画像分割におけるエラーに起因する）外れ値を識別し、排除します。 重要な表現型を識別するために、Zスコアを使用してください。 Zスコア>と表現型を考えてみましょう-2間-2と-4 Zスコアのように穏やかな表現型Zスコアと有意でない、表現型として≤-4のような強いです。 実験のニーズに応じたパラメータの組み合わせをプロットします。