生成和多表型高内涵筛选<em>贝氏柯克斯体</em>转座子突变体

1.产生的绿色荧光蛋白标记的Coxiella座子突变体库处理贝氏柯克斯体 RSA439 NMII在生物安全防护水平2（BSL-2）的微生物安全柜（MSC）符合当地规则。如果与所使用的细菌模型兼容，重复步骤从1.4.1至1.4.4增加获得克隆的突变体的可能性。一个典型的突变体文库是由许多突变体，它等于编码注解中所使用的生物体的基因组序列的三倍的数量（至少）。 制备电感受态Coxiella RSA439 NMII： 制备1×ACCM-2 13：13.4 mM柠檬酸，16.1 mM柠檬酸钠，3.67毫磷酸钾，1mM氯化镁，0.02 1mM氯化钙，0.01mM的硫酸铁，125.4毫氯化钠，1.5mM的L-半胱氨酸0.1克/升细菌用胰蛋白胨，2.5克/升酪蛋白氨基酸，1g / L的甲基的β环糊精125 30ml / L的RPMI。调节pH值至4.75和过滤消毒（不要高压）。注意：液体ACCM-2是稳定的，在4℃下进行约1个月。 接种百毫升ACCM-2的2×10 6个基因组当量（GE）的Coxiella RSA439 NMII / ml的（从先前产生并在步骤1.5定量为细菌股票）-80℃储存和分发细菌悬液在75 cm 2的细胞培养瓶与瓶盖排放（10 – 15毫升菌悬液每烧瓶）。在5％CO 2和2.5％O 2的潮湿气氛中生长7天，在37℃。 汇集所得的细菌悬浮液在50毫升管和离心机在3900×g离心1小时，在4℃。 弃上清，重悬沉淀在30ml 10％的甘油。离心机在3900 XG 1小时，4℃。 重悬沉淀，在10％甘油（通常为2毫升）和等分试样加入50μl于500μl管的足够体积。请再悬浮b在整个过程中acteria冰上。注：在此阶段，细菌是电感受和一个等份足以执行一个电穿孔。该细菌悬浮液可以储存在-80℃下6个月或直接用于质粒DNA的电穿孔。 电穿孔transposon-和转座编码质粒主管Coxiella的： 注：以下协议中，转座子与转座由两个不同的质粒（PITR-CAT-GFP和pUC19-Himar1C9，分别）进行编码7。两个质粒缺乏Coxiella特定复制起点，使他们自杀质粒时Coxiella电。这可确保稳定的转座子插入。转座因子含有下Coxiella子p1169进行选择而根据Coxiella启动子P311标记用GFP产生的突变体的调节的gfp基因的调控中氯霉素抗性盒。 镨电子冷却0.1厘米电比色皿在冰上10分钟。混合50微升电感受Coxiella的用10μg转座子的质粒和10微克转座质粒7。确保质粒浓度高于500微克/毫升，以减少稀释甘油。 电穿孔使用以下设置：18千伏，500Ω，25μF。确保所得到的时间常数是由9和13毫秒之间。 立即加入950微升的RPMI，悬浮电细菌和转移到螺旋盖管中并保持在室温下。 取200微升电细菌，并添加至3ml ACCM-2的补充有1％热灭活的胎牛血清（FBS）的入6孔板中。添加88微升的DMSO至电穿孔细菌的剩余量在-80℃下（以达到10％的DMSO终浓度），并存储。 选择转座子突变体： Incuba德在5％CO 2和2.5％O 2的潮湿气氛上述（1.2.4），为描述的接种的6孔板过夜，在37℃。添加适当的抗生素（375微克/毫升卡那霉素或3微克/毫升氯霉素）。孵育细菌培养在上述条件下3个额外的天。 单个孤立的突变体： 固体ACCM-2板的制备Coxiella座子突变体和镀层注：以下说明适用于1培养皿，细菌培养的几个稀释度都进行测试，以评估最佳的接种量为菌落分离。 热火10.5毫升0.5％琼脂糖在微波炉，让它在55℃水浴中冷却。加热11.25毫升2×ACCM-2（pH值为4.75），在37℃。 准备底部琼脂糖： 将10毫升融化的0.5％琼脂糖，用10 2×ACCM-2中并加入适当的抗生素（375微克/毫升卡那霉素或3微克/毫升氯霉素）。 立即倒入培养皿。保持培养皿unlidded，让介质凉30分钟，并风干20分钟。 准备顶琼脂糖： 混合1.25毫升2×ACCM-2的0.75毫升水在5ml的聚苯乙烯管中，加入合适的抗生素（375微克/毫升卡那霉素或3微克/毫升氯霉素）和在37℃。 添加细菌培养（通常为1至100微升）和涡旋5秒。 0.5毫升融化的琼脂糖，混匀并立即倒在底部琼脂糖。 让冷却20分钟，更换盖培养皿上，并孵育在4℃下20分钟，以促进琼脂糖固化。 空气干燥unlidded在MSC 20分钟。生长板在37℃在5％CO 2和2.5％O 2的潮湿气氛为6至7天。 添加DMSO中的其余的细菌升培养物中，以达到10％的DMSO的最终浓度，并储存在-80℃。 评估最佳稀释度如下：确保菌落是0.5到1毫米​​的直径和被适当隔离，以避免交叉污染。解冻作为1.4.1.2 1.4.1.3和上描述ACCM-2琼脂其余由点及1.4.2平板细菌培养，在适当的稀释。如在1.4.1.3.5中所述孵育6至7天。 一旦菌落检测的，通过切割1毫升尖的端部，采摘插头含有分离菌落并在1.5 ACCM-2毫升含有适当抗生素（375微克分散的菌落通过移液收集它们/ ml卡那霉素或3微克/ ml氯霉素）在一个24孔板中。扩增单个菌落6天在1.3.1中描述的条件。在培养的第3天，吹打每一种文化驱散细菌团块。 存储每个突变体悬浮液中的2D条形码螺旋盖试管中的96孔板中10％DMSO中于-80℃。 评价细菌浓度的： 注意：下面的协议可以被应用以获得细菌的突变体复制在无菌培养基（参见1.4.4）的生长曲线。 标准曲线的制备： 制备双链DNA的2微克/ ml储备溶液（通常是随机的质粒已知大小和浓度的）在1×的Tris-EDTA（TE）。制备10倍系列从原液稀释，得到浓度为2微克/ ml至2纳克/毫升。分配50μl的各浓度，以单个井96孔微孔板用黑色壁和底部的（ 见表材料 ）。 稀释的dsDNA定量试剂1：200于1×TE缓冲液，并添加55微升的稀释试剂的每个样品在96孔微量。拌匀使用板摇床孵育2至5分钟，在室温下，在黑暗中。 使用发出荧光测量荧光的样品NCE酶标仪和过滤器标准的荧光波长（激发〜480纳米，发射520〜纳米）。 暗算的荧光强度读数质粒浓度范围。 菌悬液定量： 分配5微升10％的Triton X-100，每孔在96孔微量培养板用黑色壁和底部（ 见表材料 ）。加入50微升的细菌悬浮液的每个孔中，在室温下孵育10分钟，在板振荡器上。 稀释的dsDNA定量试剂1：200于1×TE缓冲液，并添加55微升的稀释试剂的每个样品在96孔微量。拌匀使用板摇床孵育2至5分钟，在室温下，在黑暗中。 衡量使用荧光酶标仪和过滤器标准荧光波长（激发〜480纳米，发射〜520纳米）的样品荧光。 为了获得细菌DN的浓度，绘制荧光读数点1.5.1.4在得到的图。由Coxiella基因组（2.2蛋白原）的质量除以所述DNA浓度以获得细菌的浓度。结果表达基因组中当量/毫升。 放弃参展的突变体在ACCM-2显著生长缺陷。 2.单引物菌落PCR，测序和注释注意：下面的协议是96个样品的DNA扩增，多道移液器推荐用于以下步骤。使用磁珠和DNA测序用的转座子特异性引物（2.3）PCR产物的柱纯化分包给外部公司。 确保扩增引物设计，以100和200个碱基对的反向串联重复序列（ITR），上游获得的PCR产物覆盖上Coxiell转座子插入位点之间杂交的基因组。制备3毫升PCR混合物中（1×高保真缓冲液，200μM的的dNTPs，1μM的扩增引物，20U / ml的高保真DNA聚合酶）和分配，每孔29微升，在96孔PCR板在冰上进行设置。转移1μl的各突变体的稳定期在ACCM-2到PCR混合物。 运行的PCR与初始变性（98℃，1分钟），20高严紧循环（98℃，10秒; 50℃，30秒; 72℃，90秒），30低严格循环（98℃， 10秒; 30℃，30秒; 72℃，90秒）和30高严紧循环（98℃，10秒; 50℃，30秒; 72℃，90秒），随后在72最终延伸°加热7分钟。 纯化使用磁珠和序列的DNA与转座子特异性引物的PCR产物。用介于50℃和75℃，40％和60％之间的GC含量，18和25个核苷酸和退火SI之间的长度的预测熔解温度设计转座子特异性引物德扩增引物杂交位点的下游和至少100个碱基对的第一个碱基对转座子ITR的上游。 使用序列分析软件，加载贝氏柯克斯体493 NMI的完整的带有注释的基因组。使用“对齐参考”函数来加载和对准（BLASTN）的测序结果，并确定换位的部位。丢弃与非匹配和/或显示双reads.To监视突变体文库的饱和突变体，保持的多个转座子插入的发生的一个记录在相同的位点。 3.真核细胞挑战，Coxiella突变体的细胞内生长监测注：多道移液器建议以下步骤。感染实验重复3次在无菌的96孔微孔板用黑色墙壁和平坦的透明底部。重量贝氏柯克斯体表达GFP14瓦特由罗伯特·海因岑博士提供。 生长的Vero细胞在RPMI无补充有10％胎牛血清（FBS），酚红在缺乏抗生素（完全RPMI培养基）。 感染前一天，洗Vero细胞从汇合或亚汇合细胞培养瓶中，用10ml PBS中。 分离Vero细胞中加入1毫升的胰蛋白酶EDTA溶液向细胞培养烧瓶中，并在5％CO 2的潮湿气氛下孵育3至5分钟，在37℃。 重悬的细胞在10ml完全RPMI培养基中。计数细胞并制备每毫升10 5个细胞的细胞悬浮液。 分配100μl的细胞悬浮液在黑色96孔板与平坦的透明底的每个孔中。 离心5分钟，在400×g离心在RT以促进细胞粘附在孔的底部，并在5％CO 2的潮湿气氛中孵育过夜，在37℃。 解冻含钴的96孔板在RT xiella突变体和稀释150μl的细菌悬浮液中加入300微升的RPMI的不含酚红和FBS在深孔96孔平板。 从含有Vero细胞微孔板除去介质和分配100μl/孔的稀释Coxiella突变体（MOI为100）。使用A1孔作为阴性（非感染细胞）的控制和孔A2和A3作为阳性对照（细胞感染重量Coxiella表达GFP 14在100和200的感染复数（MOI）的多重）。 使用气密性离心机板保持离心板10分钟，400×g离心在RT。 在5％的CO 2的潮湿气氛中在37℃进行2小时，然后更换含细菌的培养基用100μl/孔的新鲜的完全RPMI培养基。 测量GFP荧光日常使用荧光酶标仪和过滤器标准的荧光波长（激发〜480纳米，发射〜520纳米）7天。避免干扰由于缩合和信号分散在培养基中，使用底激发和发射记录在酶标仪。 4.准备样品的自动图像采集注意：程序是一个96孔板中，相应地扩展卷。从4.2的步骤可能采取洗板机的优势。 在第 7天感染后，从板除去培养基并用50μl替换/孔的新鲜完全培养基含有细胞可渗透荧光染料在适当的稀释液（通常为1：1000，以根据所使用的细胞系进行优化）。在5％CO 2的潮湿气氛中60分钟，在37℃ -孵育细胞30。 用50μl/孔的4％低聚甲醛（PFA）的PBS替换培养基，孵育30分钟，在室温（RT），然后除去含PFA缓冲液和洗3次，用PBS洗涤。 删除PBS和dispens的孔的封闭液（0.5％牛血清白蛋白，50mM的氯化铵在PBS，pH 7.4）中补充有0.05％皂苷ë50微升/。在室温下孵育30分钟。 500稀释：用40微升/孔的补充有皂苷新鲜阻断溶液（如上）和用抗LAMP1抗体以1更换封闭液。孵育板30分钟，在室温。 除去阻断溶液并用100μl/ PBS中的孔洗涤96孔板5次。 分配40微升/孔封闭溶液补充有皂苷（如上述），适当的荧光标记的第二抗体（稀释度1：1000），以揭示施加在步骤4.4抗LAMP1抗体，并用Hoechst 33258在5微克/毫升。孵育板30分钟，在室温。 除去阻断溶液并用100μl/ PBS中的孔洗涤96孔板5次。离开PBS中对应于96孔板的最后一次洗涤的体积，作为固定细胞不应该干。 图像立即将板或存储板在4℃，避光，用于随后的分析。 5.图像采集获得在GFP图像（488纳米，细菌），赫斯特33258（350纳米，宿主细胞核），红色（〜555nm处，细胞膜标记物）和远红光（约615纳米，LAMP1）使用落射荧光自动显微镜频道配用20倍的目标。收购每孔21个独立的字段，以图像的最小每个样品5000细胞。申请使用的宿主细胞的细胞核信道作为参考自动对焦。当用细菌病原体感染宿主细胞的低百分比的工作，用户可以调整每孔成像独立字段的数量，以便获得最小500感染的细胞的分析。 6.图像处理注：以下步骤是特定的使用图像分析软件CellProfiler的。在所有情况下，最佳algoritHM为分割必须通过实验确定和触摸图像的边界的对象应具有合适功能来消除。 加载所有图像CellProfiler。 使用模块“ImageMath”从Hoechst的通道中减去使用GFP通道，以避免检测Coxiella菌落（也被标识由Hoechst），为在下面的步骤的宿主细胞的细胞核。 从得到的步骤6.2的图像使用该模块“IdentifyPrimaryObjects”分割宿主细胞的细胞核。命名分段对象“核”。 使用步骤6.3种子检测到的核555纳米图像使用模块“IdentifySecondaryObjects”分割宿主细胞。命名分段对象“细胞”。 （可选）使用该模块“IdentifyTertiaryObjects”减去确定从确定在6.4步步细胞细胞核6.3。命名分段对象“细胞质221 ;. 使用在615纳米图像模块“EnhanceOrSuppressFeatures”删除背景和促进LAMP1阳性车厢下面的标识。 使用在步骤6.6中得到的图像上的模块“IdentifyPrimaryObjects”来标识LAMP1阳性隔间。命名分段对象“溶酶体”。 使用488纳米图像模块“IdentifyPrimaryObjects”来标识Coxiella殖民地。命名分段对象“殖民地”。 使用在615纳米图像模块“IdentifySecondaryObjects”来标识使用步骤6.8种子检测Coxiella菌落含Coxiella-空泡。命名分段对象“校准检验”。 使用模块“MaskObjects”以选择在细胞上检测到的CCVs（如细胞触摸图像的边界已被淘汰，一些的CCVs可以检测“外”细胞）。命名水库ulting对象“过滤校准检验”。 使用模块“MaskObjects”以选择在细胞上检测到的菌落（如细胞触摸图像的边界已被淘汰，一些菌落可被检测的“外部”细胞）。命名结果对象“过滤的殖民地”。 使用该模块“MaskObjects”溶酶体关联到细胞。命名结果对象“过滤溶酶体”。 使用该模块“MaskObjects”选择包含Coxiella克隆细胞。命名结果对象“感染细胞”。 使用该模块“相关对象”设置对象“过滤的校准检验”作为父对象“细胞”的孩子。这将允许计数的CCVs /细胞的数目。 使用该模块“相关对象”设置对象“过滤的殖民地”的父对象“细胞”的孩子。这将允许计数菌落/细胞的数目。 使用该模块“相关对象”设置对象“过滤溶酶体”作为父对象“细胞”的孩子。这将允许计数溶酶体/细胞的数目。 使用该模块“MeasureObjectSizeShape”获得核，细胞，过滤校准检验，过滤殖民地过滤溶酶体的形态分析使用模块“MeasureObjectIntensity”量化与筛选的CCVs关联的GFP荧光，并估计内的CCVs Coxiella复制的效率。 使用模块“OverlayOutlines”和“SaveImages”叠加分割结果和用于质量控制的原始图像。 使用模块“ExportToSpreadsheet”导出全部或选择的图像分析结果。 （可选）使用该模块“ExportToDatabase”分析结果使用该软件CellProfiler分析师。 7.数据分析对于每个参数获得，识别和消除异常值（由于在图像分割错误）然后每突变体计算的平均值。 利用Z分数来确定显著的表型。考虑表型与Z值> -2非显著，表型-2和-4为轻度和表型之间的Z值与Z分数≤-4强。 根据实验需要情节的参数组合。