成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

2006年に山中らは初めて多能性状態¹への体細胞の再プログラミングの可能性を示すことができました。この脱分化は、4つの転写マウス線維芽細胞でのOct4、Sox2の、Klf4及びc-Myc因子の過剰発現によって達成されました。生成されたいわゆる人工多能性幹細胞（iPS細胞）は胚性幹細胞（ESC）に機能的な等価性を示し、したがって、成体生物のすべての細胞型に分化することができます。後で性IPSCに再プログラム一年は、ヒト線維芽細胞²のために達成することができます。動物モデルにおける実験は、iPS細胞由来の細胞は、一般に、パーキンソン病^（PD）3-5に、例えば 、細胞置換療法に使用することができることを実証します。しかし、性IPSCの使用に関連するいくつかの制限は、それらの治療の可能性を完全に実現するための障害物を表します。まず第一に、多能性状態への細胞の再プログラミングとその後品質管理は、一般的に大規模なので、高価な細胞培養の手順で得た時間がかかり、非効率的なプロセスです。第二に、性IPSCは、生物医学アプリケーションの前に、目的の所望の細胞型に再分化される必要があり、分化した集団中の残留多能性細胞の確率がかなりの腫瘍形成能力を保有し、したがって、細胞移植後⁶高リスクが表示されます。第三に、初期化プロセスは、通常lenti-またはレトロウイルス感染によって、再プログラミング因子を誘導することによって達成されます。宿主ゲノムへのこれらのウイルスの統合は、挿入突然変異誘発および/ ​​または導入遺伝子^7,8の制御されない活性化につながる可能性があります。非統合システムが挿入突然変異及びトランスジーン活性化の危険性を最小限にする、標的細胞への再プログラミング因子を送達するために開発されてきました。これらの導入遺伝子のないアプローチの例は、非組み込みを用いた細胞の再プログラミングされていますアデノまたはセンダイウイルス^9,10、DNAベースのベクター¹¹または組換えタンパク質^13,14の合成mRNAを¹²または形質導入のトランスフェクションなどのDNAフリー法の適用。導入遺伝子を含まないiPS細胞の誘導のためのもう一つの有望な方法は、loxP配列で修飾されたレンチウイルスの再プログラミングの構築物の使用とのCre-loxP配列のDNA組換えシステム^15,16を用いて、導入遺伝子のその後の欠失です。

細胞置換療法のための神経細胞を生成するために、より簡単な方法は、有糸分裂後のニューロン^17-20への線維芽細胞の直接変換を表します。 Vierbuchen らは、転写の過剰発現は、マウス線維芽細胞^17〜20％のニューロンの生成にASCL1、Brn2とMyt1l結果因子と報告しました。 2011年にはNeuroD1の過剰発現と組み合わせて、同じ3つの転写因子がノイへのヒト線維芽細胞の分化転換を可能にすることが、示されましたRONS ^19。人為的なニューロンは、デュアルSMAD-とGSK3β-阻害²⁰下ASCL1とNgn2の過剰発現によって生成することができます。注目すべきは、ニューロンへの線維芽細胞の直接変換をさらに拡大し、バイオバンクを許可していない非増殖性、有糸分裂後の細胞集団を生成します。

最近では、増殖性神経幹/前駆細胞集団への線維芽細胞の直接変換は^、21-26を報告しました。明確にするために、すべてのこれらの細胞型は、このレポートに誘導される神経前駆細胞（iNPCs）と命名されます。 Han らは iNPCsを生成するBrn4、Sox2、c-Myc、およびKlf4を過剰発現します。一次組織または多能性細胞のいずれかに由来し、それらの神経幹細胞の対応と同様に、これらのiNPCsはtripotentialであり、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト²¹に分化することができました。当社グループは、Sox2の、Klf4の過剰発現を伴うわずかに異なる変換プロトコルを報告しました、およびc-Mycおよびわずか5日間誘導されたOct4-式。このアプローチでは、我々は再プログラミング^22因子の完全な抑制を示し、マウス胚および成体の線維芽細胞から安定して増殖するiNPCsを生成することができます。性IPSCとは対照的に、iNPCsは、移植後の²⁷腫瘍形成能を示さありません。我々はiNPCs ²²臨床的に有用であることが実証された、脱髄の動物モデル、ミエリン欠損ラットに正常に変換細胞を使用しました。それまでは、NPCは唯一の多能性幹細胞または一次神経組織^28-32から生成することができます。 iNPCsは凍結保存し、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトに分化することができますすることができ、安定拡張可能な細胞です。多くの努力は、ヒト細胞^23,26,33,34に対するマウスから直接変換プロトコルを適応させるためになされています。 2012年には、線維芽細胞におけるSox2の単一因子の過剰発現は、マウスおよびヒトiNPCsを生成するのに十分であることが発表されました<s> 33アップ。著者らは、胎児包皮線維芽細胞からのヒトiNPCsの発生を報告し、Sox2のとネスチンに対して染色することによって、それらを特徴とします。しかし、再プログラミングのために使用される標的細胞は、臨床で利用できるようにして行われ、動物モデルでの移植によって変換された細胞の機能的特徴付けがなかったしません、非常に特定の細胞型を表します。より最近の刊行物は、Sox2の、C-MycおよびBrn2またはBrn4 ³⁴のいずれかの過剰発現によりヒト胎児線維芽細胞からのニューロン限定前駆細胞の生成を説明しています。生成された細胞株は、自己再生能を示し、末端神経の様々なタイプに分化することができます。これらの細胞は異種の起源であり、1つは、残留例えば、製剤中の神経堤幹細胞の存在を除外することはできませんしかし、胎児線維芽細胞の使用は、好ましくない。 2014年に、朱らは、ヒト成人とネオの直接変換を報告しました単独でのOct4またはOct4のと共にSox2の過剰発現及び細胞培養培地への小分子の添加によりtripotential神経前駆細胞への出生線維芽細胞。注目すべきは、彼らの研究のSox2のに基づいて、単独で直接変換^26を誘導するのに不十分でした。さらに最近では、呂らは山中の過剰発現は、拡張可能tripotential神経の発生で温度上昇の結果により、ウイルスの24時間およびその後の不活性化のためにセンダイウイルスによってOct4-、Sox2-、Klf4-、C-Mycの因子ことを報告しました前駆細胞^23。結論として、ヒト細胞に公開変換プロトコルはこれまで、共通の山中因子の少なくとも一つ以上の過剰発現を持っているが、多くの場合、タイムリーな制限された方法で、直接駆動するのに必要な最小限の分子要因の明確な兆候はありませんiNPCsへの変換。タイムリーな制限されたいずれかの遺伝的手段によるのOct4の過剰発現、合成mRNAを用いたトランスフェクション、またはcエル透過性共にSox2の、KLF-4、およびc-mycの構成的発現を有するタンパク質は、まだ安定人間INPC線をもたらさありませんでした。このように、センダイウイルスのアプリケーションは、すべての山中因子を過剰発現し、タイムリー^22,31がこれまで得意な作戦を表す一緒に最適化された神経のメディア誘導条件とウイルス²³の熱不活性化することによってその活性を制限します。

いくつかの研究は、NSCの、または異なる動物疾患モデルにおけるそれらの分化対応の携帯の機能を実証します。ヒト多能性幹細胞から神経前駆細胞は、神経炎症性疾患、多発性硬化症^35,36のマウスモデルに移植されています。 EAEにおけるhESC由来神経前駆細胞の適用性（実験的自己免疫性脳脊髄炎）-miceは最初2008年に示された^35。多能神経前駆細胞は、マウスの脳の脳室に注入し、移植の結果EAEの臨床徴候の減少に編。 Kim らは、ヒトES細胞からのオリゴデンドログリア前駆体を生成し、EAE-マウスに脳室内のものを移植しました。移植は10日以上生存しなかったが、マウスは、神経機能および白質³⁶において炎症誘発性免疫細胞の減少の有意な改善を示しました。幹細胞療法はまた、NPCのに成功し、それぞれの動物モデルで使用することができるように前臨床パーキンソン病の標的化のために適用されています。このために、前駆細胞は、いずれの多能性幹細胞^38-40または^41が使用された間葉系幹細胞から分化した胎児脳組織³⁷から誘導しました。 2012年には、我々は、マウスiNPCsはミエリン欠損（MD）のラット²²の脳に移植後のプロテオリタンパク質、主要ミエリンタンパク質成分を、生成することができることを示しました。その証明の原理実験治療applicabilによるiNPCsの性は、最初に証明され、すぐに別の研究³²で確認しました。しかし、人間のiNPCsの治療的使用の完全な可能性が探求されていません。

ここでは、（i）皮膚生検を介して、成人患者からのヒト初代細胞の誘導、神経前駆状態にヒト線維芽細胞の（ii）の直接変換およびニューロンに分化するiNPCsの（iii）の能力の堅牢かつ統合されたプロセスを表示しますおよびグリア系統。このプロトコルの使用は、治療用途のための自家ヒト細胞の生成を高速化するのに役立ちます。