Et nytt program av det elektriske Penetration Graph (EPG) for Anskaffelse og måling av elektriske signaler i barken Sieve Elements

Evnen til å produsere langdistanse elektriske signaler er en fordelaktig egenskap av flercellede organismer som muliggjør en effektiv respons på ytre stimuli. Denne egenskap har utviklet seg uavhengig i planter og dyr, og er derfor en sak av konvergent evolusjon. Gitt at elektriske signaler er kombinert med viktige funksjoner i dyr så som neural overføring og muskelkontraksjon, den molekylære basis, mekanisme for overføring, og funksjon av stimuleringsinduserte elektriske signaler i dyr er fag av intensiv forskning. I kontrast, har stimulus-indusert elektriske signal i planter fikk lite forskning oppmerksomhet. Selv om plantene har ingen nerver eller muskler, synes det å være nok bevis til å anta at stimulanse-indusert elektriske signaler i planter spille en nøkkelrolle i sine svar til miljøfaktorer.

Phloem, den levende del av anlegget blodkar, har blitt foreslått som en viktig subStrate for overføring av stimulanse-indusert elektriske signaler, fra stimuleres / skadet til ikke-stimulerte / uskadde områder ^to. De viktigste cellene i barken er sikte elementer (SES), relativt enkle, langstrakte celler. Endene av SES er forbundet med annen SE, danner en kontinuerlig, lav motstand, sil rørsystem som er spredt gjennom hele anlegget. Det er imidlertid svært få studier på de elektriske egenskapene til disse svært spesialiserte celler. I disse tidligere studier, forskere vist SES med enten glass mikroelektroder ^tre eller med glass elektroder som ble koblet til plante-innsatte styleter av bladlus, etter stylectomy (kutting) ^4. Glassmikroelektroder er laget av glasskapillærer som er trukket i en ende med varme i en fin spiss på mindre enn en mikrometer i diameter, og deretter fylt med en KCl-løsning. A Ag / AgCl eller platinatråd, satt inn i KCl-fylte glasselektrode blir deretter koblet til forsterkerinngangen og en referanseelektroden føres inn i badet som omgir cellen av interesse og fullfører kretsen. Dette oppsettet registrerer forskjellen i potensialet mellom det ekstracellulære referent elektroden og den intracellulære måleelektroden, det vil si, den membranpotensialet i cellen ^5. Med denne metoden Umrath gjorde den første intracellulære opptaket fra en plantecelle, ved hjelp av alger Nitella ^6,7. Nitella er et relativt enkelt organisme med store celler, og derfor mottagelig for intracellulære elektrofysiologiske eksperimenter. I motsetning til dette, er innsettingen av intracellulære glasselektroder i de små celler av multi-cellulære, tredimensjonale landplanter teknisk krevende, krever en meget dyktig forsker, samt sofistikerte visualisering, mikromanipulasjon, og anti-vibrasjonsutstyr. Selv om glasselektroder er egnet til å ta opp fra overfladiske celler i planter, for eksempel root epidermalceller ^8, intracellulær recordings fra celler dypt forankret i anlegget vev, slik som SES, svært sannsynlig forårsake skade-indusert reaksjoner, forvirrende resultatene. I 1989 rapporterte Fromm og Eschrich bruk av en alternativ metode, som kalles den "bladlus metoden, hvor glass-elektrodene er koplet til bladlus stylets etter stylectomy ^4. Aphid metoden er minimal invasiv, fordi fleksible stylets ikke forårsaker vev eller celleskade som glasselektroder gjøre. Bladlus stylets er naturens flott oppfinnelse for anleggs penetrasjon, og bladlus er betydelig mer dyktige enn mennesker med å finne SES. Dessverre er dette aphid metoden også svært krevende i form av teknisk kompetanse og utstyr. Dessuten lykkes i hvert forsøk som implementerer denne teknikken er helt avhengig av bladlus være i foringsmodus – med stilett stabilt innført i en SE, ved stylectomy. Tenker i retrospektiv, kan man se at oddsen for å lykkes med denne teknikken kunne ha vært improved ved å legge til den eksperimentelle oppsettet et instrument som gjør det mulig å identifisere hvorvidt bladlus stylet er i SE når du søker stylectomy.

I 1964, McLean og Kinsey beskrevet en "elektronisk overvåkingssystem" for studiet av fôring atferd av bladlus i sanntid ^9,10. I dette systemet, ble det bladlus og stilett-penetrert anlegget integrert i en elektrisk krets. Senere, i 1978, Tjallingii utviklet en modifisert versjon av systemet, kalt "Elektrisk Penetration Graph" (EPG) system ^11,12. Mens det opprinnelige elektronisk overvåkingssystem var følsom for motstands-stammer potensialer bare, med EPG-systemet, den elektromotoriske kraft (EMF) stammer potensialer, dvs. generert på planten eller i insektet, kan bli registrert i tillegg til potensialer som oppstår motstand (R) i insektet. Dette utgjør en viktig forbedring, fordi begge signalkomponenter, emf og R,gi biologisk relevant informasjon om hendelser i anlegget penetrasjon av bladlus. Det som gjør EPG forforsterkeren følsom for de R-komponentene er dens forholdsvis lave inngangsmotstand av en GΩ, som ligger nær gjennomsnittet av anlegget / bladlus motstand. En liten forskyvningsspenning (figur 1, V) på ca. 100 mV påføres på planten, som deretter er delt på tvers av plante- og insekt på den ene side, og inngangsmotstanden på den andre. Spenningene og deres endringer er målt i et punkt (figur 1A, B) mellom insekt og inngangsmotstand. Derfor R-komponentene representerer plante bladlus motstand modulasjoner av offset spenningen, mens de EMF-komponenter er en viss brøkdel av plante potensialer ved stylet tips og potensialer forårsaket i insekt. Anlegget potensialer – mest relevante her – er i hovedsak membran potensialene av plantecellene punktert av bladlus stylets. Insekt potensialer ser ut til å være hovedsakeligstrømningspotensialene forårsaket av flytende bevegelser i løpet av de to stylet kanalene, dvs. mat og spytt kanalene; ingen interne nerve eller muskel potensialer føres i EPG. I praksis stilett spissen virker som en elektrodespiss. Alle planteceller er negativt ladet på innsiden i forhold til den positive utsiden av cellen. Den elektriske strøm (dvs. den bevegelse av ladede ioner i vandig oppløsning) som strømmer fra innsiden til utsiden og omvendt meget begrenset på grunn av den høye motstand av cellemembranen. Normalt hvilepotensialet holdes konstant. Imidlertid, når negative ioner beveger seg ut eller positive ioner beveger seg i gjennom cellemembranen, er membranpotensialet redusert, det vil si, det depolariserer '. Depolarisering forekommer i tilfelle av celle eksitasjon. Ioner deretter flytte inn eller ut når bestemte ionekanaler i membranen er åpnet eller når membranen er skadet og ioner lekke inn og ut. Alle celler har ionekanaler og pumper i tHan plasmamembranen som bringer membranpotensialet til sitt hvilenivå ved å gjenopprette den opprinnelige konsentrasjonen av forskjellige ioner inne i cellen. Hvilepotensialet og dens endringer er EMF komponenter, og derfor er det EPG teknikk egnet til å måle dem.

Figur 1. EPG-elektroder. EPG-elektroden er en levende bladlus integrert inn i det elektriske Penetration Graph (EPG) krets, hvis stilett er satt inn en sikt element (SE) i stabil foringsmodus. Dersom stilett-spiddet SE er i ro (panel A), spenningen i kretsen, registrert av EPG, er stabilt og på hvilepotensial nivå (panel C, Rest). Hvis SE er spent, dets membran depolariserer (panel B), som er visualisert i EPG som en gradvis økning i spenning (panel C, depolarisering). Som ioniske balanse i SE returnerer til hvile, dvs. det repolartegner, spenningen registrert av EPG gradvis reduseres til resten potensielle nivå (Panel C, repolarisering). I panel C, "A" og "B" refererer til scenariene er vist i panel A og B, respektivt. V = Justerbar offset spenning kilde. Ri = Input motstand. Parallelt med en GΩ ekstern motstand, har en intern forsterker (i operasjonsforsterkeren) 1,5 TΩ høy motstand (panelene A og B, i grått). Med fjernkontroll av bryteren EPG pre-amp kan endres fra normal til EMF-modus, som gjør det mulig å oppnå svært nøyaktige spenningsverdier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I neste avsnitt, gir vi leseren en grunnleggende protokollen for å utføre EPG-eksperimenter som er gyldig for både insekt-fokusert og plante-fokuserte studier.