Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

As células estaminais embrionárias são células pluripotentes derivadas do embrião com a capacidade de proliferar indefinidamente in vitro, mantendo a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células dos adultos após reintrodução num embrião fase adequada (através da formação de uma quimera), injecção em hospedeiros singénicos ou imunocomprometidos (através da formação de um teratoma) ou in vitro sujeitos a estímulos apropriados ^1. A diferenciação in vitro de células estaminais embrionárias de ratinho em linhagens neurais foi descrita pela primeira vez em 1995 e envolveu a formação de agregados multicelulares suspensão (corpos embrióides, EBS) em meio contendo soro suplementado com o ácido retinóico morfogénio ^2-4. Uma vez que, em seguida, uma variedade de protocolos têm sido desenvolvidos para permitir a diferenciação neuronal ^5. Muitos ainda utilizar agregação, os outros co-cultura com indução de tipos de células e vários envolvem a utilização de meios isentos de soro. Todos os protocolos tem vantagens umand desvantagens e a natureza precisa da neural ou células neuronais produzida também varia de acordo com o protocolo utilizado.

O protocolo ideal seria robusta, escalável e fazer uso de meios totalmente definidos e substratos, ser passíveis de monitorização não invasiva do processo de diferenciação e resultar na geração de populações puras de células progenitoras neurais capazes de ser modelado por sinais externos e para diferenciar em todos os subtipos neuronais e gliais com elevada eficiência e rendimento em relativamente pouco tempo. Nos últimos doze anos, temos vindo a utilizar um método para gerar progenitores neurais e neurônios de rato ESC em uma baixa densidade, cultura monocamada aderente sem soro ^6-10. Este protocolo cumpre muitos dos critérios enunciados anteriormente: em nossas mãos a eficiência de diferenciação tem sido bastante consistente ao longo de muitos anos e uma variedade de linhas de células, ele pode ser escalado para cima ou para baixo (que usamos com sucesso navios de placas de 96 poços para 15 cm de diâmetro diela é) e os meios usados ​​são bem definidos. O processo é passível de microscopia Timelapse para o controlo da diferenciação e uma variedade de padrões de sinais pode ser adicionado para induzir a geração de tipos distintos de subtipos neuronais (por exemplo, a Shh e Fgf8 para neurónios dopaminérgicos ^6).

No entanto, existem alguns desafios para o sucesso da aplicação deste protocolo. Um dos aspectos fundamentais é uma preparação cuidadosa da mídia. Nós sempre preparar a mídia in-house, apesar da disponibilidade de alternativas comerciais. Um dos suplementos usados ​​(N2; ver Protocol) tem modificações sobre o padrão versões disponíveis no mercado. Finalmente, uma das etapas mais importantes para a aplicação bem sucedida deste método é a densidade celular óptima para o chapeamento. Isto é principalmente devido ao passo que a natureza autócrina de um dos sinais indutores (FGF4 ¹¹⁾ requer que as células estão presentes suficientes para permitir viabil óptimadade e diferenciação, em muito altas densidades diferenciação é prejudicada (possivelmente em parte devido à produção autócrina de LIF ^12). Portanto, é importante que a preparação ambos os meios e revestimento celular são realizadas com cuidado e de forma consistente para assegurar os melhores resultados.