Trattamento dei prodotti piastrinici con riboflavina e luce UV: Efficacia Contro alto titolo contaminazione batterica
Summary
The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.
Abstract
Contaminazione di unità di piastrine da parte dei batteri è da tempo riconosciuto come un rischio significativo di trasfusione a causa delle loro condizioni di conservazione post-donazione. I prodotti sono ordinariamente conservati a 22 ° C in un agitatore agitazione, una condizione che può promuovere la crescita batterica. Sebbene il numero totale di batteri che si ritiene essere introdotti in un prodotto piastrinico è estremamente basso, questi batteri possono moltiplicarsi ad un alto titolo prima della trasfusione, potenzialmente causando gravi eventi avversi. Lo scopo di questo studio era di valutare un processo di riduzione dei patogeni riboflavina basato contro un gruppo di batteri che sono stati identificati come contaminanti comuni dei prodotti piastrinici. Questo pannello comprendeva i seguenti organismi: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae. Ogni unità di piastrine è stato inoculato con una carica batterica elevata e campioni sono stati rimossi bOTH prima e dopo il trattamento. Una colonia formando test, utilizzando un sistema di punti di diluizione fine, è stata utilizzata per determinare le pre-trattamento e post-trattamento titoli batteriche. Riduzione logaritmica è stato calcolato sottraendo il titolo post-trattamento dal titolo pretrattamento. Sono stati osservati i seguenti riduzioni di log: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99,95%), B. neotomae 5.4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) e K . pneumoniae 2.8 log (99,8%). I risultati di questo studio suggeriscono il processo potrebbe contribuire a ridurre il rischio di gravi eventi avversi associati alla trasfusione contaminazione batterica.
Introduction
La trasfusione di piastrine, plasma, globuli rossi confezionati e prodotti di sangue intero svolgono un ruolo importante nella medicina moderna e può essere usato per il trattamento di varie condizioni mediche, sostituire i liquidi vitali e, infine, salvare vite umane. Le piastrine sono un prodotto cellulare che sono o isolati da sangue intero e riunito in una dose transfusable o raccolti attraverso il processo di aferesi piastrinica. Il ruolo principale di piastrine nel corpo è quello di fermare l'emorragia nei siti della ferita e per aiutare a mantenere l'emostasi. I pazienti affetti da una conta delle cellule delle piastrine basso (trombocitopenia) sono suscettibili di eventi di sanguinamento spontaneo e sono trasfusi con piastrine per portare contare di nuovo in un range di normalità loro cella piastrine. Piastrine raccolti sono conservati per un massimo di 5-7 giorni e sono conservati a 22 ± 2 ° C, mentre sotto costante agitazione.
Nonostante il risparmio proprietà di trasfusioni di piastrine vita ci rimane un lieve rischio per ricevono trasfusioni a causa di contamination di questi prodotti da parassiti, batteri e virus 11. L'attuazione di test virale acidi nucleici (NAT) è diminuito in modo significativo il rischio di trasmissione virale ematica principali agenti, come il virus dell'epatite C (HCV), il virus dell'epatite B (HBV) e del virus di immunodeficienza umana (HIV) 5. Una recente pubblicazione dal Canadian Blood Services stima il rischio residuo per questi agenti siano 1 per 8 milioni di donazioni per l'HIV, 1 per 6,7 milioni di donazioni per l'HCV e 1 per 1,7 milioni di donazioni per l'HBV 15.
Anche se i batteri tipicamente garner meno attenzione nel pubblico in generale, la frequenza di contaminazione batterica nei prodotti piastrinici è stata stimata essere alto come 1: 1.000 7 e perché milioni di prodotti piastrinici vengono trasfusi ogni anno molti destinatari sono esposti a potenzialmente in pericolo di vita complicazioni come la sepsi 6. La ricerca suggerisce che la carica batterica al momentodi contaminazione è basso, <100 unità formanti colonie (CFU) / prodotto 2,16, ma l'ambiente e la temperatura ambiente ricco di stoccaggio di nutrienti permette contaminando batteri di proliferare a pericolosamente alti titoli prima della trasfusione. Attualmente, i metodi approvati disponibili per evitare prodotti batteriologicamente contaminati da raggiungere un destinatario piastrinica è attraverso l'uso di sistemi di coltura e rapide punto di test cura. Brevemente, per sistemi di coltura basati prodotti piastrinici sono memorizzati su un agitatore a 22 ° C per 12-24 ore per permettere ai batteri di proliferare nel prodotto, su cui un campione 4-8 ml viene rimosso dal prodotto piastrinico e inoculata in una bottiglia contenente terreni di coltura. La bottiglia è posto in uno strumento che monitora la bottiglia per la crescita batterica. Se lo strumento rileva crescita batterica in bottiglia è contrassegnato e la corrispondente unità di piastrine viene scartato. Mentre questo processo è un ragionevole successo a rilevare gro veloceorganismi ala, molte delle specie a crescita lenta non crescono ad un titolo abbastanza alta da rilevare, creando così il potenziale per unità di falsi negativi per essere rilasciato per trasfusioni 7,12,14,16,22. A differenza dei sistemi di coltura a base di rilevamento, un rapido punto di test cura viene in genere eseguito più tardi nel periodo di conservazione delle piastrine in cui la carica batterica è aumentato significativamente. I titoli più elevati sono richiesti dal punto di test per la cura sono meno sensibili rispetto ai sistemi di coltura basati, e solo di rilevare in modo affidabile i batteri una volta raggiunta un titolo ≥1 x 10 3 CFU / ml 17. Tuttavia tali test possono fornire risultati entro 1 ora di campionamento. La variabilità nello svolgimento di queste prove hanno portato al rilascio di un prodotto falso negativo, provocando una reazione settica fatale nel ricevente 9.
Un modo alternativo per combattere il problema della contaminazione batterica di prodotti piastrinici è attraverso l'uso di routine di un proc riduzione degli agenti patogeniess che possono inattivare batteri contaminanti, invece di cercare di individuarli. Utilizzando riboflavina come fotosensibilizzatore, in combinazione con la luce UV, ha dimostrato di ridurre l'infettività di una vasta gamma di contaminanti patogeni ematica, inclusi batteri 3,4,8,10,19-21 .Il uso di riboflavina e UV luce per la riduzione degli agenti patogeni non è tossico e non mutagena, e componenti leggeri trattati con riboflavina e UV hanno dimostrato di essere sicuro per riceventi trasfusioni, nonché a chi tratta prodotti ematici 18. In breve, le molecole di riboflavina possono associare gli acidi nucleici (DNA e RNA) di batteri, parassiti, virus e ogni cellula nucleata (ad esempio, globuli bianchi). L'esposizione alla luce UV si attiva riboflavina, causando una modificazione chimica gruppi funzionali degli acidi nucleici (principalmente basi guanina), impedendo così la replicazione e / o la trascrizione degli acidi nucleici e lasciando l'organismo inattivato 13. Cellule Anucleated come piattoville in globuli rossi non sono influenzati dalla chimica riboflavina causa della mancanza di acido nucleico.
Lavoro precedente con la tecnologia riboflavina e ai raggi UV ha valutato un gruppo selezionato di batteri utilizzando un disegno sperimentale destinato a simulare un prodotto piastrinico contaminato con una carica batterica clinicamente rilevante (<20 CFU / prodotto) 8. L'obiettivo di questo studio era di valutare il processo di luce e ai raggi UV contro riboflavina alto titolo contaminazione batterica (> 1,0 x 10 5 CFU / ml) in prodotti piastrinici trattati nel plasma per misurare la capacità di riduzione batterica totale del sistema. Sulla base dei dati raccolti da studi hemovigilance 1, un gruppo di comuni che si verificano gram microrganismi positivi negativi e gram è stato selezionato per la valutazione in questo studio e comprendeva le seguenti specie: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ,Brucella neotomae, Bacillus cereus (forma vegetativa), Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae. Tutti gli organismi, ad eccezione di B. cereus, sono stati ottenuti da ATCC e una priorità fu posta su ottenere ceppi batterici che sono stati identificati come essere isolato da componenti del sangue. Il B. cereus testato in questo studio è un ceppo isolato clinico internamente da un prodotto piastrinico contaminato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo screening batterica è diventata pratica comune in istituti bancari di sangue e per molte posizioni che serve come il metodo principale per prevenire trasfusione di piastrine batteri contaminati. Sebbene lo screening batterica interdice in genere la maggior parte dei rapida crescita batteri Gram negativi come S. marcescens, E. coli ed E. cloacae, si fa fatica a rilevare lenta crescita batteri Gram-positivi, come S. aureus, Streptococcus spp. e S. epidermidis 8. Purtroppo, questi batteri Gram positivi e tre sono implicati in rialzo del 50% di tutte le unità di piastrine contaminati e trasfusione di prodotti piastrinici contenenti questi tre organismi ha portato a mortalità dei pazienti 1.
Proiezione batterica si basa sul titolo batterica in un prodotto piastrinico essere abbastanza sufficientemente alto in modo che almeno un microrganismo è contenuto all'interno del tipico esempio di screening 4-8 ml. Se il titolo batterico non è sufficientemente elevato per un batterio da catturare nel volume del campione 4-8 ml, l'unità è in modo non corretto contrassegnato come negativo e viene rilasciato per la trasfusione. Un approccio alternativo allo screening batterica potrebbe essere quella di impiegare un processo proattivo che può essere eseguito su tutte le unità di piastrine e che potrebbe rendere i organismi contaminanti come non funzionale.
In questo studio, alti titoli di batteri sono stati volutamente aggiunti unità di piastrine per testare la capacità totale riduzione del processo di riduzione della luce patogeno riboflavina e UV. Sebbene le cariche batteriche testati in questo studio molto superiori a quelle normalmente presenti nei prodotti ematici al momento della donazione, questo studio aiuta a dimostrare che il processo riboflavina e la luce UV è in grado di ridurre in modo significativo il titolo di batteri vitali in una unità di piastrine contaminato da 2.6 al 5.4 log (riduzione 99,7-99,9996% dei batteri contaminanti) (Figura 2). Per ottenere un accuravalore di riduzione logaritmica te, è fondamentale che l'operatore ha una buona tecnica asettica con precise competenze pipettaggio quando si eseguono le operazioni di titolo batteriche. Pipettaggio impreciso quando si eseguono diluizioni seriali può portare ad un accumulo di errori, quindi una misurazione titolo impreciso.
I dati raccolti in questo studio supporta lavoro precedente con riboflavina e raggi UV, che ha sfidato il sistema contro di basso livello, batteriemia clinicamente rilevante (<20 CFU / unità). Lo studio precedente è stato progettato per simulare un evento reale contaminazione clinica ei risultati hanno mostrato riboflavina e la luce UV è stato efficace nel prevenire la crescita batterica nel corso del periodo di conservazione delle piastrine di 7 giorni. Modellazione sulla base dei dati del precedente studio suggerisce che le attuali stime di rischio di contaminazione batterica dei prodotti piastrinici potrebbero essere ridotti di ben il 98% rispetto ai livelli attuali 8. Il processo di luce riboflavina e UV confronta favorevolmente a schermo battericaING, che ha dimostrato solo una efficacia del 66% per rilevare contaminanti batterici nelle unità di piastrine quando provocati con una carica batterica clinicamente rilevante 8.
Come per tutte le tecnologie, trattamento PRT di prodotti piastrinici per prevenire le complicanze associate alla unità di piastrine batteri contaminati ha i suoi limiti. Sistemi PRT non sono efficaci contro le spore batteriche e non inattivano endotossine, quindi anche se un sistema PRT può inattivare alti titoli di batteri Gram-negativi il endotossine residuo può ancora causare shock settico nel ricevente. PRT è meglio eseguita presto durante la conservazione prima che i batteri possono propagare a titoli elevati.
In conclusione, come dimostrato dalla combinazione di questi due studi, il processo di riboflavina e la luce UV è efficace nel ridurre le cariche batteriche di entrambi i microrganismi Gram positivi e Gram negativi e può offrire una valida alternativa allo screening batterica. Ordinariamente treatinprodotti g piastrine con riboflavina e raggi UV ha anche il vantaggio di ridurre la potenziale trasmissione di altri agenti per via ematica, come virus e parassiti.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Mirasol Illuminator | Terumo BCT | N/A | |
| Mirasol Treatment/Storage Bag | Terumo BCT | N/A | |
| Hematology Analyzer | Beckman-Coulter | Ac•T diff | |
| Blood Gas Analyzer | Siemens | RapidLab 1265 | |
| Sterile Docking Device | Terumo BCT | TSCD | |
| Platelet Incubator | Helmer | PC2200 | |
| Orbital Incubator Shaker | Lab-Line | 4628 | |
| Dry Incubator | Fisher | Iso-temp | |
| Class II A/B3 Biosafety Cabinet | Thermo-forma | 1286 | |
| Tubing Sealer | Sebra | Smart Sealer II | |
| Table Top Centrifuge | IEC | Centra GP8R | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| 30 mL Syringe | BD | 309650 | |
| 5 mL Dilution Tube | VWR | 211-0058 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 430290 | |
| Micropipette | Gilson | P-200 | |
| Micropipette | Rainin | R-200 | |
| Repeat Pipette | Eppendorf | 4780 | |
| 1-200 µL Filter Tip | Costar | 4810 | |
| 25 mL Disposable Serrological Pipette | Costar | 4489 | |
| 5 mL Disposable Serrological Pipette | Costar | 4487 | |
| 35 mL 500 µM Riboflavin | Terumo BCT | 35 mL 500 µM | |
| Brucella Agar with 5% Horse Blood | BBL | 221547 | |
| Brain Heart Infusion | Teknova | B9993 | |
| Peptone Water | BD | 257087 | |
| Trypticase Soy Broth | BD | 299113 | |
| Trypticase Soy Agar | Remel | R01917 | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050 |
References
- Brecher, M. E., Hay, S. N. Bacterial contamination of blood components. Clin. Microbiol. Rev. 18 (1), 195-204 (2005).
- Brecher, M. E., Holland, P. V., Pineda, A. A., Tegtmeier, G. E., Yomtovian, R. Growth of bacteria in inoculated platelets: implications for bacteria detection and the extension of platelet storage. Transfusion. 40 (11), 1308-1312 (2000).
- Cardo, L. J., et al. Pathogen inactivation of Leishmania donovani infantum in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Vox Sang. 90 (2), 85-91 (2006).
- Cardo, L. J., Salata, J., Mendez, J., Reddy, H., Goodrich, R. Pathogen inactivation of Trypanosoma cruzi in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Transfus. Apher. Sci. 37 (2), 131-137 (2007).
- Dodd, R. Y. Current viral risks of blood and blood products. Ann. Med. 32 (7), 469-474 (2000).
- Dodd, R. Y. Bacterial contamination and transfusion safety: experience in the United States. Transfus. Clin. Biol. 10 (1), 6-9 (2003).
- Dumont, L. J., et al. Screening of single-donor apheresis platelets for bacterial contamination: the PASSPORT study results. Transfusion. 50 (3), 589-599 (2010).
- Goodrich, R. P., Gilmour, D., Hovenga, N., Keil, S. D. A laboratory comparison of pathogen reduction technology treatment and culture of platelet products for addressing bacterial contamination concerns. Transfusion. 49 (6), 1205-1216 (2009).
- Greco-Stewart, V. S., et al. Serratia marcescens strains implicated in adverse transfusion reactions form biofilms in platelet concentrates and demonstrate reduced detection by automated culture. Vox Sang. 102 (3), 212-220 (2012).
- Keil, S. D., et al. Inactivation of Plasmodium spp. in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Transfusion. 53 (10), 2278-2286 (2013).
- Kleinman, S., Chan, P., Robillard, P. Risks associated with transfusion of cellular blood components in Canada. Transfus. Med Rev. 17 (2), 120-162 (2003).
- Larsen, C. P., Ezligini, F., Hermansen, N. O., Kjeldsen-Kragh, J. Six years’ experience of using the BacT/ALERT system to screen all platelet concentrates, and additional testing of outdated platelet concentrates to estimate the frequency of false-negative results. Vox Sang. 88 (2), 93-97 (2005).
- Mundt, J. M., Rouse, L., Van den Bossche, J., Goodrich, R. P. Chemical and Biological Mechanisms of Pathogen Reduction Technologies. Photochem. Photobiol. , (2014).
- Murphy, W. G., et al. Screening platelet concentrates for bacterial contamination: low numbers of bacteria and slow growth in contaminated units mandate an alternative approach to product safety. Vox Sang. 95 (1), 13-19 (2008).
- Brien, S. F., et al. Current incidence and residual risk of HIV, HBV and HCV at Canadian Blood Services. Vox Sang. 103 (1), 83-86 (2012).
- Pearce, S., Rowe, G. P., Field, S. P. Screening of platelets for bacterial contamination at the Welsh Blood Service. Transfus. Med. 21 (1), 25-32 (2011).
- Ramirez-Arcos, S., Kou, Y., Perkins, H. Evaluation of a universal point-of-issue assay for bacterial detection in buffy coat platelet components. Vox Sang. 107 (2), 192-195 (2014).
- Reddy, H. L., et al. Toxicity testing of a novel riboflavin-based technology for pathogen reduction and white blood cell inactivation. Transfus. Med. Rev. 22 (2), 133-153 (2008).
- Ruane, P. H., et al. Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light. Transfusion. 44 (6), 877-885 (2004).
- Tonnetti, L., Proctor, M. C., Reddy, H. L., Goodrich, R. P., Leiby, D. A. Evaluation of the Mirasol pathogen reduction technology system against Babesia microti in apheresis platelets and plasma. Transfusion. 50 (5), 1019-1027 (2010).
- Vanlandingham, D. L., et al. Photochemical inactivation of chikungunya virus in plasma and platelets using the Mirasol pathogen reduction technology system. Transfusion. 53 (2), 284-290 (2013).
- Walther-Wenke, G., et al. Monitoring bacterial contamination of blood components in Germany: effect of contamination reduction measures. Vox Sang. 100 (4), 359-366 (2011).
