Le traitement des produits plaquettaires avec riboflavine et la lumière UV: Efficacité contre Haute Titer contamination bactérienne
Summary
The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.
Abstract
La contamination des unités de plaquettes par les bactéries est reconnu depuis longtemps comme un risque de transfusion en raison de leur importante des conditions de stockage après le don. Les produits sont stockés en routine à 22 ° C dans un agitateur sous agitation, une condition qui peut promouvoir la croissance bactérienne. Bien que le nombre total de bactéries censées être introduits dans un produit de plaquettes est extrêmement faible, ces bactéries peuvent se multiplier à un titre très élevé avant la transfusion, ce qui pourrait entraîner des effets indésirables graves. Le but de cette étude était d'évaluer un processus de réduction des agents pathogènes de la riboflavine base sur un panel de bactéries qui ont été identifiés comme des contaminants courants de produits plaquettaires. Ce groupe comprenait les organismes suivants: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa et K. pneumoniae. Chaque unité plaquettaire a été inoculé avec une charge bactérienne élevée et ont été retirés des échantillons both avant et après traitement. Une colonie essai de formation, en utilisant un schéma point de dilution final, a été utilisé pour déterminer les titres bactériennes pré-traitement et de post-traitement. Connexion réduction a été calculé en soustrayant le titre du titre de pré-traitement de post-traitement. Les réductions de journaux suivants ont été observés: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4.0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B. neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 journal (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) et K . pneumoniae 2,8 log (99,8%). Les résultats de cette étude suggèrent que le processus pourrait aider à réduire le risque de graves incidents transfusionnels indésirables associés à la contamination bactérienne.
Introduction
La transfusion de plaquettes, plasma, globules rouges emballés et de produits sanguins entiers jouent un rôle majeur dans la médecine moderne et peut être utilisé pour traiter diverses conditions médicales, remplacer les liquides vitaux et, finalement, sauver des vies. Les plaquettes sont un produit cellulaire qui sont soit isolé à partir de sang total et regroupées dans une dose transfusable ou sont collectées à travers le processus d'aphérèse. Le rôle principal de plaquettes dans le corps est pour arrêter le saignement au niveau des sites de la plaie et pour aider à maintenir l'hémostase. Les patients souffrant d'une faible numération cellulaire plaquettaire (thrombocytopénie) sont sensibles aux événements de saignements spontanés et sont transfuser des plaquettes à apporter leur cellule de numération plaquettaire de nouveau dans une fourchette normale. Les plaquettes collectées sont stockées pour un maximum de 5-7 jours et sont conservés à 22 ± 2 ° C tout sous agitation constante.
Malgré le gain de propriétés de transfusions de plaquettes vie, il reste un léger risque pour les receveurs de transfusion en raison de contamination de ces produits par les parasites, les bactéries et les virus 11. La mise en œuvre des tests d'acide nucléique viral (NAT) a diminué de façon significative le risque de transmission virale de diffusion hématogène principaux agents, tels que le virus de l'hépatite C (VHC), virus de l'hépatite B (VHB) et le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) 5. Une publication récente de l'Société canadienne du sang estime que le risque résiduel pour ces agents serait de 1 pour 8 millions de dons pour le VIH, 1 par 6,7 millions de dons pour le VHC et 1 par 1,7 million de dons pour le VHB 15.
Bien que les bactéries Garner généralement moins d'attention dans le grand public, la fréquence de la contamination bactérienne dans les produits de plaquettes a été estimée à être aussi élevé que 1: 1000 7 et parce que des millions de produits plaquettaires sont transfusées chaque année de nombreux bénéficiaires sont exposés à un danger de mort des complications comme la septicémie 6. La recherche suggère que la charge bactérienne à l'époquede contamination est faible, <100 unités formant colonie (UFC) / produit 2,16, mais le riche environnement et la température ambiante entreposage d'éléments nutritifs permet bactéries contaminantes à proliférer dangereusement élevés des titres avant la transfusion. Actuellement, les méthodes approuvées seulement disponibles pour empêcher les produits contaminés par des bactéries d'atteindre un destinataire de plaquettes est par l'utilisation de systèmes fondés sur la culture et point rapide de tests de soins. En bref, pour les systèmes de culture à base de produits de plaquettes sont stockées sur un agitateur à 22 ° C pendant 12 à 24 h pour permettre aux bactéries de proliférer dans le produit, sur lequel un échantillon de 4-8 ml est éliminé du produit de plaquettes et inoculé dans un flacon contenant des milieux nutritifs. La bouteille est placée dans un instrument qui surveille la bouteille pour la croissance bactérienne. Si l'instrument détecte la croissance bactérienne dans la bouteille, il se trouve en position et l'unité de plaquettes correspondant est éliminé. Bien que ce processus est raisonnablement réussi à détecter gro rapideorganismes de l'aile, la plupart des espèces à croissance lente ne poussent pas à un titre suffisamment élevé pour être détecté, créant ainsi le potentiel d'unités faux négatifs à être libéré pour la transfusion 7,12,14,16,22. Contrairement fondés sur la culture des systèmes de détection, le point rapide de tests de soins est généralement effectuée plus tard dans la période de stockage des plaquettes lorsque la charge bactérienne a augmenté de manière significative. Les titres plus élevés sont nécessaires puisque le point de tests de soins sont moins sensibles que les systèmes fondés sur la culture, et seulement détecter de manière fiable les bactéries une fois qu'ils atteignent un titre ≥1 x 10 3 UFC / ml 17. Cependant, de tels tests peuvent fournir des résultats en 1 heure de l'échantillonnage. La variabilité de la performance de ces tests ont conduit à la libération d'un produit de faux négatifs, ce qui provoque une réaction septique fatale chez le receveur 9.
Une autre manière de lutter contre le problème de la contamination bactérienne de produits plaquettaires est grâce à l'utilisation de routine d'un proc de réduction des agents pathogènesESS qui peuvent inactiver les bactéries contaminantes lieu d'essayer de les détecter. Utilisation de la riboflavine comme photosensibilisant, en combinaison avec de la lumière UV, on a démontré à réduire l'infectivité d'un large éventail de contaminants pathogènes à diffusion hématogène, y compris les bactéries 3,4,8,10,19-21 .L'utilisation de riboflavine et UV la lumière pour la réduction des agents pathogènes est non-toxique et non mutagène, et riboflavine et UV composants légers traités ont été montré pour être sans danger pour les transfusés ainsi que pour ceux qui manipulent les produits sanguins 18. En bref, des molécules riboflavine peut associer aux acides nucléiques (ADN et ARN) des bactéries, des parasites, des virus et des cellules nucléées (par exemple les globules blancs). L'exposition à la lumière UV active la riboflavine, ce qui provoque une modification chimique de groupes fonctionnels des acides nucléiques (bases de guanine principalement), empêchant ainsi la réplication et / ou la transcription des acides nucléiques et en laissant l'organisme inactivé 13. Cellules anucléées comme plaqueet permet aux globules rouges ne sont pas affectés par la chimie de la riboflavine en raison de l'absence de l'acide nucléique.
Des travaux antérieurs avec la technologie la riboflavine et la lumière UV a évalué un groupe restreint de bactéries en utilisant une conception expérimentale visant à imiter un produit plaquettaire contaminé par une charge bactérienne cliniquement pertinente (<20 UFC / produit) 8. Le but de cette étude était d'évaluer le processus de riboflavine et la lumière UV contre la contamination bactérienne de titre élevé (> 1,0 x 10 5 UFC / ml) dans les produits plaquettaires traités dans le plasma afin de mesurer la capacité de réduction bactérienne totale du système. Basé sur des données recueillies à partir d'études d'hémovigilance 1, un panel d'survenant couramment organismes Gram positifs et négatifs du gramme a été sélectionné pour l'évaluation dans cette étude et inclus les espèces suivantes: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ,Brucella neotomae, Bacillus cereus (forme végétative), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumoniae. Tous les organismes, à l'exception B. cereus, on a obtenu auprès de l'ATCC et la priorité a été placée obtention de souches bactériennes qui ont été identifiés comme étant isolé à partir de composants sanguins. Le B. cereus testée dans cette étude est une souche clinique isolée à l'intérieur d'un produit plaquettaire contaminé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Détection bactérienne est devenu pratique courante dans les établissements bancaires de sang et pour de nombreux endroits, il sert comme la principale méthode pour empêcher transfusion de plaquettes contaminés par des bactéries. Bien que le dépistage bactérienne interdits généralement la majorité de croissance rapide des bactéries Gram-négatives telles que S. marcescens, E. E. coli et cloacae, il a du mal à détecter croissance lente bactéries à Gram positif comme S. aureus, Streptococcus spp. et S. 8 epidermidis. Malheureusement, ces bactéries Gram positives trois sont impliqués dans plus de 50% de toutes les unités de plaquettes contaminées et la transfusion de produits plaquettaires contenant ces trois organismes a conduit à la mortalité des patients 1.
Criblage bactérienne repose sur le titre bactérienne dans un produit plaquettaire être assez suffisamment élevée pour que au moins un organisme est contenu dans le criblage typique échantillon de 8.4 ml. Si le titre bactérien est pas suffisamment élevée pour une bactérie à saisir dans le volume d'échantillon de 4-8 ml, l'unité est incorrectement marqué comme négatif et il est libéré pour transfusion. Une approche alternative au dépistage bactérienne pourrait être d'employer un processus proactif qui peut être effectuée sur toutes les unités de plaquettes et qui pourraient rendre les organismes contaminants que la non-fonctionnelle.
Dans cette étude, des titres élevés de bactéries ont été ajoutées exprès aux unités de plaquettes de tester la capacité du processus de réduction des agents pathogènes riboflavine lumière UV et réduction totale. Bien que les charges bactériennes testés dans cette étude dépassent de loin ceux qui se trouvent normalement dans les produits sanguins au moment du don, cette étude permet de démontrer que le processus de la riboflavine et la lumière UV est capable de réduire de façon significative le titre de bactéries viables dans une unité de plaquettes contaminées par 2,6 à 5,4 log (réduction de 99,7 à 99,9996% d'bactéries contaminantes) (figure 2). Pour obtenir une accurate valeur de réduction logarithmique, il est essentiel que l'opérateur possède une bonne technique aseptique ainsi que des compétences de pipetage précis lorsque vous effectuez les étapes de titre bactériennes. Pipetage imprécis lors de l'exécution des dilutions en série peut conduire à une accumulation d'erreurs, donc une mesure de titre inexacte.
Les données recueillies dans cette étude prend en charge les travaux antérieurs avec la riboflavine et la lumière UV, qui contestait le système contre le faible niveau, la bactériémie cliniquement pertinente (<20 UFC / unité). L'étude précédente a été conçu pour imiter un événement clinique réel de contamination et les résultats ont montré la riboflavine et la lumière UV a été efficace dans la prévention de la croissance bactérienne au cours de la période de stockage des plaquettes de 7 jours. Modélisation basée sur les données de l'étude précédente suggère que les estimations actuelles du risque de contamination bactérienne de produits plaquettaires pourraient être réduits par autant que 98% des niveaux actuels 8. Le processus de riboflavine et la lumière UV se compare favorablement à l'écran bactérienneING, qui ne fait preuve d'une efficacité de 66% pour détecter les contaminants bactériens dans les unités de plaquettes en cas de contestation avec une charge bactérienne cliniquement pertinente 8.
Comme avec toutes les technologies, le traitement PRT de produits plaquettaires pour prévenir les complications associées à des unités de plaquettes contaminés par des bactéries a ses limites. Systèmes PRT ne sont pas efficaces contre les spores bactériennes et ne inactivent endotoxine, donc même si un système PRT peut inactiver des titres élevés de bactéries à Gram négatif l'endotoxine restant peut encore provoquer un choc septique chez le receveur. PRT est préférable d'effectuer tôt au cours du stockage avant que les bactéries peuvent se propager à des titres élevés.
En conclusion, comme l'a démontré par la combinaison de ces deux études, le processus de la riboflavine et la lumière UV est efficace pour réduire les charges bactériennes des deux organismes Gram positifs et Gram négatif et peut offrir une alternative viable au dépistage bactérienne. Régulièrement treating produits plaquettaires avec la riboflavine et la lumière UV a aussi l'avantage de réduire la transmission potentielle d'autres agents transmissibles par le sang comme les virus et les parasites.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Mirasol Illuminator | Terumo BCT | N/A | |
| Mirasol Treatment/Storage Bag | Terumo BCT | N/A | |
| Hematology Analyzer | Beckman-Coulter | Ac•T diff | |
| Blood Gas Analyzer | Siemens | RapidLab 1265 | |
| Sterile Docking Device | Terumo BCT | TSCD | |
| Platelet Incubator | Helmer | PC2200 | |
| Orbital Incubator Shaker | Lab-Line | 4628 | |
| Dry Incubator | Fisher | Iso-temp | |
| Class II A/B3 Biosafety Cabinet | Thermo-forma | 1286 | |
| Tubing Sealer | Sebra | Smart Sealer II | |
| Table Top Centrifuge | IEC | Centra GP8R | |
| 10 mL Syringe | BD | 309604 | |
| 30 mL Syringe | BD | 309650 | |
| 5 mL Dilution Tube | VWR | 211-0058 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 430290 | |
| Micropipette | Gilson | P-200 | |
| Micropipette | Rainin | R-200 | |
| Repeat Pipette | Eppendorf | 4780 | |
| 1-200 µL Filter Tip | Costar | 4810 | |
| 25 mL Disposable Serrological Pipette | Costar | 4489 | |
| 5 mL Disposable Serrological Pipette | Costar | 4487 | |
| 35 mL 500 µM Riboflavin | Terumo BCT | 35 mL 500 µM | |
| Brucella Agar with 5% Horse Blood | BBL | 221547 | |
| Brain Heart Infusion | Teknova | B9993 | |
| Peptone Water | BD | 257087 | |
| Trypticase Soy Broth | BD | 299113 | |
| Trypticase Soy Agar | Remel | R01917 | |
| Heat Inactivated Horse Serum | Gibco | 26050 |
References
- Brecher, M. E., Hay, S. N. Bacterial contamination of blood components. Clin. Microbiol. Rev. 18 (1), 195-204 (2005).
- Brecher, M. E., Holland, P. V., Pineda, A. A., Tegtmeier, G. E., Yomtovian, R. Growth of bacteria in inoculated platelets: implications for bacteria detection and the extension of platelet storage. Transfusion. 40 (11), 1308-1312 (2000).
- Cardo, L. J., et al. Pathogen inactivation of Leishmania donovani infantum in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Vox Sang. 90 (2), 85-91 (2006).
- Cardo, L. J., Salata, J., Mendez, J., Reddy, H., Goodrich, R. Pathogen inactivation of Trypanosoma cruzi in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Transfus. Apher. Sci. 37 (2), 131-137 (2007).
- Dodd, R. Y. Current viral risks of blood and blood products. Ann. Med. 32 (7), 469-474 (2000).
- Dodd, R. Y. Bacterial contamination and transfusion safety: experience in the United States. Transfus. Clin. Biol. 10 (1), 6-9 (2003).
- Dumont, L. J., et al. Screening of single-donor apheresis platelets for bacterial contamination: the PASSPORT study results. Transfusion. 50 (3), 589-599 (2010).
- Goodrich, R. P., Gilmour, D., Hovenga, N., Keil, S. D. A laboratory comparison of pathogen reduction technology treatment and culture of platelet products for addressing bacterial contamination concerns. Transfusion. 49 (6), 1205-1216 (2009).
- Greco-Stewart, V. S., et al. Serratia marcescens strains implicated in adverse transfusion reactions form biofilms in platelet concentrates and demonstrate reduced detection by automated culture. Vox Sang. 102 (3), 212-220 (2012).
- Keil, S. D., et al. Inactivation of Plasmodium spp. in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Transfusion. 53 (10), 2278-2286 (2013).
- Kleinman, S., Chan, P., Robillard, P. Risks associated with transfusion of cellular blood components in Canada. Transfus. Med Rev. 17 (2), 120-162 (2003).
- Larsen, C. P., Ezligini, F., Hermansen, N. O., Kjeldsen-Kragh, J. Six years’ experience of using the BacT/ALERT system to screen all platelet concentrates, and additional testing of outdated platelet concentrates to estimate the frequency of false-negative results. Vox Sang. 88 (2), 93-97 (2005).
- Mundt, J. M., Rouse, L., Van den Bossche, J., Goodrich, R. P. Chemical and Biological Mechanisms of Pathogen Reduction Technologies. Photochem. Photobiol. , (2014).
- Murphy, W. G., et al. Screening platelet concentrates for bacterial contamination: low numbers of bacteria and slow growth in contaminated units mandate an alternative approach to product safety. Vox Sang. 95 (1), 13-19 (2008).
- Brien, S. F., et al. Current incidence and residual risk of HIV, HBV and HCV at Canadian Blood Services. Vox Sang. 103 (1), 83-86 (2012).
- Pearce, S., Rowe, G. P., Field, S. P. Screening of platelets for bacterial contamination at the Welsh Blood Service. Transfus. Med. 21 (1), 25-32 (2011).
- Ramirez-Arcos, S., Kou, Y., Perkins, H. Evaluation of a universal point-of-issue assay for bacterial detection in buffy coat platelet components. Vox Sang. 107 (2), 192-195 (2014).
- Reddy, H. L., et al. Toxicity testing of a novel riboflavin-based technology for pathogen reduction and white blood cell inactivation. Transfus. Med. Rev. 22 (2), 133-153 (2008).
- Ruane, P. H., et al. Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light. Transfusion. 44 (6), 877-885 (2004).
- Tonnetti, L., Proctor, M. C., Reddy, H. L., Goodrich, R. P., Leiby, D. A. Evaluation of the Mirasol pathogen reduction technology system against Babesia microti in apheresis platelets and plasma. Transfusion. 50 (5), 1019-1027 (2010).
- Vanlandingham, D. L., et al. Photochemical inactivation of chikungunya virus in plasma and platelets using the Mirasol pathogen reduction technology system. Transfusion. 53 (2), 284-290 (2013).
- Walther-Wenke, G., et al. Monitoring bacterial contamination of blood components in Germany: effect of contamination reduction measures. Vox Sang. 100 (4), 359-366 (2011).
