Die intranasale Verabreichung von rekombinantem Influenza Vaccines in chimären Maus-Modelle zu Mucosale Immunität Studieren
Summary
There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.
Abstract
Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies.
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.
Introduction
Die Erzeugung von immunologischen Gedächtnisses in Abwesenheit der Krankheit ist die physiologische Grundlage für die effektive Impfung 1. In jüngster Zeit Systeme biologischer Ansätze haben gezeigt, dass eine erfolgreiche Impfstoffe wie die Gelbfiebervakzin, induzieren eine starke Induktion der angeborenen Immunantwort und Aktivierung verschiedener Untergruppen von dendritischen Zellen (DCs), die wiederum führen zur Aktivierung der antigen multilineärer spezifische T-Zellen 2,3. Da DCs sind die einzigen Immunzellpopulation mit der Fähigkeit, Antigen-spezifische T-Zellen naive 4 zu aktivieren, ist die Untersuchung von deren Funktion bei der Impfung kritisch für die Immunantwort auf Impfstoffe zu verstehen und zukünftige Strategien gegen herausfordernde Pathogene zu entwickeln.
Ein System, Rückverfolgung von verschiedenen DCs Teilmengen während der Immunantwort auf Impfstoffe wären wünschenswert, um eine genaue Kinetik der DC Migration auf lymphatischen Gewebe zu schaffen, und es daher,Einblick in die physiologischen Mechanismen für die Einleitung der Impfstoff-spezifischen adaptiven Immunität verantwortlich. Reverse Genetik basierte Ansätze bieten die Möglichkeit, modifizierte erzeugen attenuierten Impfstoffen, die experimentell mit diesem Zweck verwendet werden können. Seit ihrer Umsetzung am Influenza-Forschung hat Plasmid-basierte reversen Genetik weit verbreitet eingesetzt worden, um rekombinante Influenza-Stämme einschließlich LAIVs generieren. Standardprotokolle zur Rettung rekombinanten Influenza-Viren erfordern Mehr Transfektion von hoch transfektierbare Zelllinien mit AmbiSense Plasmide (Herstellung von positiven und negativen Sinn RNA), welche die acht Influenzavirus-Segmente sowie Verstärkung in eine permissive System wie Madin-Darby canine kidney ( MDCK-Zellen) und / oder Huhn embryonierten Eiern 5. Die Anwendung der reversen Genetik, molekulare Werkzeuge, um die Immunmechanismen der Impfung zu untersuchen erzeugen bleibt unerforscht.
Die Erzeugungneuer Mausmodelle ermöglicht spezifische Depletion von Immunzellpopulationen, einschließlich DCs hat neue Möglichkeiten eröffnet, um die grundlegenden Immunmechanismen durch Impfung hervorgerufen Schutz zugrunde zu verstehen. Der Vergleich zwischen DC Teilfunktionen in Mäusen und Menschen haben gezeigt, dass, in einem großen Ausmaß, Maus und Mensch DCs sind funktionell homolog 6,7 diese Ergebnisse stark darauf hin, dass die Entwicklung eines Maus-Modelle erlauben spezifische Depletion der DC in dem stationären Zustand und bei entzündlichen Erkrankungen, kann dazu dienen, die Physiologie der DC Reaktionen in Menschen zu verstehen. In den letzten Jahren eine Reihe von Mausmodelle erzeugt worden Durchführung Transgene Simian Diphtherietoxin (DT) Rezeptor (DTR) unter der Kontrolle der Promotorregion eines Gens von Interesse exprimieren 8,9. Seit Mausgeweben nicht natürlich auszudrücken DTR, diese Modelle zu ermöglichen bedingte Erschöpfung der Zell-Untergruppen trägt die gezielte Gen von Interesse auf der Maus Inokulation mit DT. Damit unsere ability, spezifische DCs und anderen Leukozyten in vivo bei physiologischen Prozessen führen, wurde stark von der Entwicklung der DTR-basierten ro verbessert. Während jedoch diese transgenen Mausmodelle sind sehr häufig benutzt worden, um die Ontogenese des Immunsystems zu verstehen, deren Anwendung auf die Entwicklung von Impfstoffen wurde kaum getestet. Hier wird durch die Kombination von Influenza reversen Genetik und DTR-basierten Wettbewerbsknochenmarkchimären, schlagen wir eine Methode, um die Kinetik der Impfstoff die Immunität als auch einzelne Gen-Funktion während der Immunantwort auf Impfstoffe in vivo zu untersuchen. Die Anwendung dieser Technologie für die präklinische Evaluierung neuer Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten anspruchs könnte helfen, Impfstoffentwicklung zu rationalisieren und Impfstoffkandidaten in vivo zu testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie beschreiben wir, wie reverse Genetik und chimären Maus-Modelle können verwendet werden, um die physiologischen und molekularen Mechanismen der Impfstoff-induzierte Immunität aufzuklären. Influenza reversen Genetik wird in vielen Laboren etabliert und hat eine Hauptrolle im Verständnis Influenza Pathogenese, Replikation und Getriebe 17 gespielt. Ein wichtiger Punkt in unserem Protokoll ist Rettung von kälteangepassten Grippeimpfstoffen Expression fremder Epitope. Während die Strategie d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sergio Gómez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.
Materials
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1X) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| Opti MEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
