Toma de muestras de sangre de la vena lateral de la cola de la rata
Summary
Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.
Abstract
Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.
Introduction
Biomarcadores obtenidos a partir de sangre proporcionan utilidad de diagnóstico, predicción y estratificación medidas en muchos contextos clínicos, incluyendo la enfermedad cardiovascular 1, ciencias cáncer 2 y enfermedad psiquiátrica 3. También pueden ser utilizados en la ciencia básica para evaluar el "estado" de un organismo, incluyendo el grado de hambre, la inflamación, o el estrés presente. Estas medidas pueden ser influenciados por variables que pueden o no pueden ser críticos a la pregunta de interés, incluyendo la hora del día en que se obtiene la muestra y el sexo de los sujetos. También puede estar influenciada por la tensión inducida durante el propio procedimiento de muestreo de sangre. Las hormonas del estrés y la percepción del dolor pueden alterar rápidamente la composición de la sangre.
Los roedores son el animal de laboratorio más comúnmente utilizado, y múltiples métodos han sido desarrollados para la recogida de sangre. El método ideal de muestreo de sangre debe tener physiologica mínimol impacto sobre el animal, no requieren anestesia, permite muestreo rápido y repetido, y proporcionar el volumen de sangre suficiente para numerosas aplicaciones posteriores. Técnicas populares para la recogida de la sangre, como la cateterización de la vena yugular o la amputación de la cola de punta no cumplen con estos criterios.
El objetivo de este protocolo es describir una técnica de muestreo de sangre para su uso en ratas que es mínimamente estresante, no requiere anestesia, permite múltiples colecciones de sangre dentro de un mismo tema, y ofrece un volumen de muestra relativamente grande tal que varios ensayos pueden realizarse en una sola muestra. El objetivo de este método es la obtención de muestras de sangre que están mínimamente influenciados por la respuesta de estrés agudo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un procedimiento rápido y sencillo para la obtención de una muestra de sangre de una rata que ofrece importantes ventajas sobre otras técnicas de uso común. En primer lugar, no requiere anestesia, en contraste con el muestreo de la vena yugular o seno retroorbital. Cuando se recogen muestras de sangre que rodea procedimientos conductuales, la administración de anestésicos no es deseable porque puede interferir con el aprendizaje y 4,5 memoria. En segundo lugar, ofrece la posibilidad de recoger volúmenes de sangre más grandes que otras técnicas de venopunción, como la recogida de las venas safena pedal o dorsales. Usando la técnica descrita aquí, hasta 1,5 ml de sangre se puede recoger de una rata en un solo punto de tiempo, un volumen que permite fácilmente múltiples ensayos que se ejecutan en paralelo. Por último, este procedimiento minimiza el potencial de daño a los tejidos en comparación con la amputación punta de la cola o sangrado retroorbital. El uso de este procedimiento facilita el cumplimiento del Animal WLey elfare y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, el cual requiere reducir al mínimo el dolor y la angustia que resultan de procedimientos de laboratorio realizadas en los animales.
Se recomienda que los investigadores nuevos para este método practican las técnicas de inmovilización y de sangrado de la cola con el fin de minimizar el tiempo que los animales experimentales son restringidos. La sangre recogida en menos de 3 minutos desde el inicio de la restricción proporciona resultados óptimos.
El protocolo descrito aquí puede utilizarse para el muestreo de 1 a 4 veces por semana, pero no más de dos veces por día. Mientras que las colecciones de sangre repetidas pueden llevar a cabo, diferentes sitios de muestreo que se mueven hacia arriba desde la base de la cola deben ser utilizados, y las venas de la cola izquierda y derecha deben alternarse como sitios de muestreo. El volumen total de sangre de los roedores es 6-7% de su peso corporal, y no más de 15% del volumen total de la sangre se debe recoger dentro de un período de 2 semanas. Sueroo plasma comprende aproximadamente un 40-60% del volumen de muestra recogida.
Las muestras de sangre a través de las venas de la cola laterales también se puede realizar en el ratón como se describe aquí con algunas modificaciones menores. En primer lugar, se pueden usar sólo pequeñas de calibre (27 G) catéteres. En segundo lugar, se recomienda utilizar un tubo de contención, en lugar de una envoltura, para inmovilizar los ratones. El volumen de sangre que se puede obtener desde el ratón usando venopunción del haz vascular submandibular (200-500 l) es mayor que se pueden recoger de forma segura desde la vena de la cola (200 l máximo). Debido a que el muestreo de sangre del paquete vascular submandibular requiere restricción mínima y puede producir más sangre, ésta es la ruta preferida para el muestreo en el ratón.
La rapidez con la que se puede realizar este procedimiento, junto con su naturaleza mínimamente invasiva, también minimiza la perturbación potencial de las medidas basadas en la sangre por la respuesta de estrés agudo 6. Losrespuesta al estrés agudo puede alterar los niveles circulantes de muchas moléculas, incluyendo las interleucinas y otros factores inmunes activa 7, hormonas del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal 8, hormonas en el sistema nervioso simpático 9, 10 grelina, opioides endógenos 11, dopamina, y serotonina 12. Si se desean medidas de reposo circulantes de estas moléculas u otros regulados por estas moléculas, es importante para minimizar la respuesta al estrés, que se activa dentro de tan poco como un minuto del inicio de la exposición factor estresante.
Las respuestas al estrés no sólo alteran la composición de la sangre, sino que también representan un obstáculo técnico para el muestreo debido a la constricción de los vasos de la sangre a través de una mayor unidad del sistema nervioso simpático. Se vuelve cada vez mayor dificultad para obtener el flujo de sangre constante de una rata que está montando una respuesta de estrés agudo. Por lo tanto, la angustia del animal debe ser minimzado con el fin de obtener rápidamente muestras que reflejan el estado fisiológico de interés.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Virginia Doherty y Junmei Yao para la asistencia técnica. Esta investigación fue financiada por el NIMH (R01 MH084966), y la Oficina de Investigación del Ejército de Estados Unidos y la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (conceder W911NF-10-1-0059) a KAG.
Materials
| Sodium heparin (1000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor Rinse-Chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, .75" width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
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