A amostragem de sangue a partir da veia lateral da cauda do rato

Todas as experiências foram realizadas utilizando ratos adultos machos Long-Evans. Todos os procedimentos estavam de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animal Institucional do Instituto de Tecnologia de Massachusetts e do Animal Care e Use o Office Revisão da o USAMRMC. 1. Preparação Heparinise o cateter e seringa através da colocação da agulha blindado em um tubo de 500 ul contendo heparina (1.000 unidades USP / ml) e, em seguida, aspirar e expelir solução de heparina, através da agulha. Anexar um cateter de borboleta para a seringa. Manter a blindagem sobre a agulha do cateter para proteger a ponta afiada de danos. Retirar um volume de heparina que é ligeiramente maior do que o volume de sangue que serão recolhidos. Retire a seringa e encha-o com o ar. Volte a ligar a seringa ao cateter e usar oar para expelir o excesso de solução de heparina; garantir que apenas quantidades vestigiais permanecer na tubagem, agulha e seringa. Coloque o cateter estéril, com a seringa ainda fixa, em uma superfície estéril. Garantir rapidamente o rato em um pano limpo garantindo que previsão e patas traseiras estão em uma posição confortável e respiração é irrestrita. Prenda o envoltório com gancho e laço de fita; assegurar que os genitais externos não são constringido. Peça a um assistente gentil e firmemente refrear o rato (abdômen e base da cauda) sobre uma superfície de trabalho sólida com o rabo pendurado na borda do balcão. 2. Amostragem de sangue Imergir a cauda em 42 ° C para a água de 40-50 seg para dilatar os vasos sanguíneos e secar a cauda com uma toalha de papel. Localizar a veia da cauda para ser sangrado (girar todo o corpo, com a cauda para evitar a torção da cauda). Nota: O aquecimento suficiente da cauda é crítica para a rápida collection de uma amostra de sangue. Se a vasculatura é constringido, a colocação adequada do cateter é difícil, e o fluxo sanguíneo é muito reduzido. Uma almofada de aquecimento pode ser usada como uma alternativa à imersão em água. Identificar o ponto de amostragem. Nota: A artéria se encontra ao longo do aspecto médio-dorsal da cauda; não use isso para amostragem. Alvo ambos os lados esquerdo e direito veias da cauda que se encontram lateralmente à artéria. A pigmentação da cauda, ​​que varia de acordo com a tensão e aumenta com a idade, algumas podem obscurecer da vasculatura. Alvo de um porção da veia na porção inferior da cauda. Limpe a área de alvo com solução anti-séptica de clorexidina 2%. Criar uma pressão negativa na seringa e um cateter, retirando o êmbolo de zero a cerca de 50 ul. Segure a cauda gentil e firmemente perto da ponta para manter a cauda em linha reta para coleta de amostras. Certifique-se de que o fluxo sanguíneo não for obstruído por um aperto excessivamente apertado. Lentamente inserir o cateter na veia num ângulo raso cerca de 5 cm a partir da ponta da cauda. Quando a veia é penetrado, o sangue irá fluir para dentro do cateter. Lentamente, retirar o êmbolo da seringa para recolher o volume desejado a uma taxa constante (~ 20 ul por segundo). Consulte o pessoal veterinário para obter informações sobre o volume de sangue máxima que pode ser cobrada. A quantidade máxima de sangue que devem ser recolhidos depende do status de peso e saúde do rato. Não retirar mais de 15% do volume total de sangue em um período de 14 dias. Nota: O sangue é muito mais difícil de recolher a partir de animais que foram agudamente estressados ​​nos minutos antes da coleta da amostra, pois os hormônios do estresse contraem a vasculatura. Por exemplo, mover gaiola do rato a um novo quarto, levando vários minutos para embrulhar o animal, ou inserção repetida do cateter em uma veia são todos susceptíveis de desencadear uma resposta de estresse agudo. Facilitar bloofluxo d por "ordenha" a veia. Passar um dedo ao longo do comprimento da veia, a partir da base para a ponta da cauda, ​​mas permanecem mais de 2 cm a partir da ponta da agulha inserida ou o cateter pode ficar desalojado da veia. Se o sangue não pode ser recolhido com êxito a partir do local inicial de penetração do cateter, re-inserir a agulha mais acima na veia. Se o sangue foi coletado no local inicial, re-pressurizar a agulha desligando e voltando a ligar o cateter e seringa antes da re-inserção na veia. Em geral, evitar penetrações adicionais. Como várias penetrações pode causar o colapso da veia da cauda, ​​em que o fornecimento de sangue para a cauda é cortada eo tecido macio cauda torna-se necrosada, eutanásia do rato se houver colapso veia da cauda. Quando o volume da amostra adequada ser coletada, liberar a pressão na seringa por desconectar e reconectar o cateter. Aspirar usando ligeiramente o êmbolo da seringa (~ 50 & #181; l), e retirar a agulha da veia. Nota: Se a agulha seja retirada sem primeiro libertar a pressão na seringa, o sangue vai escorrer a partir da agulha. Resumidamente aplicar pressão ao local de inserção para parar o sangramento, e limpe a área com solução anti-séptica. Retorne o rato à sua gaiola. 3. Processar a amostra de sangue Ar aspirado para garantir que nenhum sangue permanece dentro da agulha do cateter, e usar uma tesoura para cortar o tubo de cateter logo acima da agulha. Expelir o sangue em um estéril 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Nota: Se o sangue é empurrado através da agulha, a força de corte pode levar as células vermelhas do sangue para romper o que pode interferir com muitos ensaios a jusante. Remover a agulha, para evitar hemólise. Para recolher o plasma sanguíneo, que contêm tubos de uso EDTA como anticoagulante (aqui, utilizar 10 ul de EDTA 0,1 M para 200-400 ul de sangue; garantir a concentração de EDTA utilizada não interfere wom o ensaio downstream) e colocar no gelo. Rotação amostras de sangue total a 2100 xg numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) durante 10 min até 10 min de colheita. Elui-se o plasma, evitando perturbar as camadas de células de sangue vermelhas e brancas. Para a coleta de soro do sangue, amostras de lugar (sem anticoagulante) à temperatura ambiente por até 30 min para permitir a coagulação. Girar os tubos de recolha numa centrifugadora refrigerada (4 ° C) a 2000 x g. O soro pode então ser eluída. Utilize amostras imediatamente, ou armazenar a -80 ° C por até um ano.