L'échantillonnage de sang de la veine caudale latérale de la Rat

Toutes les expériences ont été effectuées en utilisant des rats mâles adultes Long-Evans. Toutes les procédures étaient en conformité avec les US National Institutes of Health (NIH) Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Institut de Technologie du Massachusetts et de la protection des animaux et l'utilisation Bureau d'examen des l'USAMRMC. 1. Préparation Heparinise le cathéter et la seringue de l'aiguille en plaçant un blindage contenant de l'héparine dans 500 ul de tube (USP 1000 unités / ml) et ensuite aspirer et expulser la solution d'héparine à travers l'aiguille. Fixez un cathéter papillon à la seringue. Gardez le bouclier sur l'aiguille du cathéter pour protéger la pointe acérée de dommages. Prélever un volume de l'héparine qui est légèrement supérieur au volume de sang qui seront recueillies. Détachez la seringue et remplissez-le avec de l'air. Re-fixer la seringue au cathéter et utiliser leair pour expulser l'excès de solution d'héparine; assurer que des traces restent dans le tube, aiguille et la seringue. Placez le cathéter stérile, avec la seringue encore attachée, sur une surface stérile. Sécuriser rapidement le rat dans un chiffon propre veiller à ce que antérieurs et pattes arrière sont dans une position confortable et la respiration est sans restriction. Fixez l'enveloppe avec crochet et la bande de boucle; veiller à ce que les organes génitaux externes ne sont pas étranglés. Avoir un assistant doucement et retenir fermement le rat (abdomen et la base de la queue) sur une surface de travail solide avec la queue pendait au bord du comptoir. 2. L'échantillonnage de sang Plonger la queue dans l'eau C 42 ° pour 40-50 sec à dilater les vaisseaux sanguins et sécher la queue avec une serviette en papier. Localisez la veine de la queue d'être saigné (tourner tout le corps avec la queue pour empêcher la torsion de la queue). Remarque: le réchauffement suffisant de la queue est critique pour la collectio rapiden d'un échantillon de sang. Si le système vasculaire est resserré, le positionnement correct du cathéter est difficile, et la circulation sanguine est nettement réduite. Un coussin chauffant peut être utilisé comme une alternative à l'immersion dans l'eau. Identifier le point d'échantillonnage. Remarque: L'artère se trouve le long de l'aspect mi-dorsale de la queue; ne pas utiliser ce pour l'échantillonnage. Cible soit les veines de la queue de gauche et de droite qui se trouvent latéralement à l'artère. La pigmentation de la queue, qui varie selon la souche et augmente avec l'âge, peut occulter une partie de la vascularisation. Cible une partie de la veine dans la partie inférieure de la queue. Essuyez la zone cible avec une solution antiseptique de chlorhexidine 2%. Créer une pression négative dans la seringue et le cathéter en retirant le piston de zéro à environ 50 ul. Tenez la queue avec douceur et fermeté près de la pointe de garder la queue droite long de la collecte de l'échantillon. Assurez-vous que le flux sanguin est pas fermé par une poignée trop serré. Insérez lentement le cathéter dans la veine à un angle faible d'environ 5 cm de la pointe de la queue. Lorsque la veine est pénétré, le sang va couler dans le cathéter. Retirer lentement le piston de la seringue pour recueillir le volume souhaité à un rythme soutenu (~ 20 pi par seconde). Consultez le personnel vétérinaire pour des informations sur le volume maximum de sang qui peuvent être recueillis. La quantité maximale de sang qui doit être recueillie dépend de l'état de santé et du poids du rat. Ne pas retirer plus de 15% du volume sanguin total dans une période de 14 jours. Remarque: Le sang est beaucoup plus difficile de recueillir des animaux qui ont été vivement soulignée dans les minutes avant le prélèvement des échantillons parce que les hormones de stress contractent le système vasculaire. Par exemple, le déménagement de la cage du rat à une nouvelle chambre, en prenant plusieurs minutes pour conclure l'animal, ou l'insertion répétée du cathéter dans une veine sont tous susceptibles de déclencher une réaction de stress aigu. Faciliter blood écoulement par «traite» la veine. Exécuter un doigt le long de la longueur de la veine, de la base vers l'extrémité de la queue, mais restent plus de 2 cm de la pointe de l'aiguille insérée ou le cathéter peut se détacher de la veine. Si le sang ne peut pas être collecté avec succès à partir du site initial de pénétration du cathéter, ré-insérer l'aiguille plus haut dans la veine. Si le sang a été prélevé sur le site initial, re-pressuriser l'aiguille en débranchant puis en rebranchant le cathéter et la seringue avant la ré-insertion dans la veine. En général, éviter les pénétrations supplémentaires. Comme pénétrations multiples peuvent provoquer l'effondrement veine de la queue, dans lequel l'approvisionnement en sang à la queue est coupée et le tissu de queue molle devient nécrosée, euthanasier le rat si il ya veine de la queue effondrement. Lorsque le volume d'échantillon suffisant est collecté, relâcher la pression dans la seringue en débranchant et en rebranchant le cathéter. Aspirer légèrement à l'aide du piston de la seringue (~ 50 & #181; l), et de retirer l'aiguille de la veine. Remarque: Si l'aiguille est retirée sans relâcher d'abord la pression dans la seringue, le sang va couler de l'aiguille. Appliquer brièvement une pression sur le site d'insertion pour arrêter le saignement, et essuyez la zone avec une solution antiseptique. Retour le rat à sa cage. 3. traitement de l'échantillon de sang Aspirer l'air pour assurer le sang ne reste à l'intérieur de l'aiguille du cathéter, et utiliser des ciseaux pour couper le tube du cathéter juste au-dessus de l'aiguille. Expulser le sang dans un tube de 1,5 ml à centrifuger stérile. Remarque: Si le sang est poussé à travers l'aiguille, la force de cisaillement peut entraîner des globules rouges à la rupture qui peut interférer avec de nombreux essais en aval. Retirez l'aiguille pour éviter l'hémolyse. Pour récupérer le plasma sanguin, les tubes contenant de l'EDTA utilisation comme anticoagulant (ici, en utilisant 10 ul d'EDTA 0,1 M de 200 à 400 pi de sang; assurer la concentration de l'EDTA utilisé ne pas interférer avecvec le dosage en aval) et placer sur la glace. Spin échantillons de sang total à 2100 x g dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C) pendant 10 min à moins de 10 min de la collecte. Éluer le plasma, ce qui évite de perturber les couches de globules rouges et blancs. Pour collecter le sérum sanguin, placer les échantillons (sans anticoagulant) à la température ambiante pendant 30 min pour permettre la coagulation. Faites tourner les tubes de prélèvement dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C) à 2000 x g. Le sérum peut ensuite être élue. Utiliser des échantillons immédiatement ou conserver à -80 ° C pendant jusqu'à un an.