Bloedafname van de Lateral staartader van de Rat

Alle experimenten werden uitgevoerd met volwassen mannelijke Long-Evans ratten. Alle procedures waren in overeenstemming met de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH) Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Massachusetts Institute of Technology en de Animal Care en gebruik Beoordeling Office of de USAMRMC. 1. Voorbereiding Heparinise de catheter en spuit door het plaatsen van de beschermde naald in een 500 pl buis met heparine (1000 USP eenheden / ml) en vervolgens opzuigen en uitstoten heparineoplossing door de naald. Bevestig een vlinder katheter aan de spuit. Houd het schild over de naald van de katheter aan de scherpe punt te beschermen tegen schade. Intrekken hoeveelheid heparine die iets groter is dan het volume van bloed dat wordt opgevangen. Maak de spuit en vul deze met lucht. Re-bevestig de spuit aan de catheter en gebruik delucht om overtollig heparine oplossing te verdrijven; garanderen dat alleen sporen achterblijven in de buis, naald en spuit. Plaats de steriele katheter, met de spuit nog steeds verbonden, op een steriel oppervlak. Snel zet de rat in een schone doek ervoor te zorgen dat de voor- en achterpoten zijn in een comfortabele positie en de ademhaling is onbeperkt. Zet de wrap met klittenband; ervoor te zorgen dat de uitwendige geslachtsorganen niet worden vernauwd. Laat een helper voorzichtig en stevig beteugelen van de rat (buik en de basis van de staart) op een solide werk oppervlak met de staart opknoping van de rand van de teller. 2. Blood Sampling Dompel de staart in 42 ° C water gedurende 40-50 sec aan de bloedvaten verwijden en droog de staart met een papieren handdoek. Zoek de staart ader te worden ontlucht (draai het hele lichaam met de staart om te voorkomen dat het verdraaien van de staart). Opmerking: Voldoende opwarming van de staart is van cruciaal belang voor de snelle Collection van een bloedmonster. Als de vasculatuur wordt vernauwd, juiste plaatsing van de katheter is lastig, en de bloedstroom wordt sterk verminderd. Een verwarmingselement kan worden gebruikt als alternatief voor onderdompeling in water. Identificeer het bemonsteringspunt. Opmerking: De slagader ligt langs de mid-dorsale aspect van de staart; Gebruik dit niet voor bemonstering. Richt de linker en rechter staartaders die lateraal van de slagader liggen. Pigmentatie van de staart, die verschilt per stam en stijgt met de leeftijd, kunnen obscure deel van het vaatstelsel. Target een gedeelte van de ader in het onderste gedeelte van de staart. Veeg het doelgebied met 2% chloorhexidine antiseptische oplossing. Maak onderdruk in de spuit en catheter door terugtrekken van de zuiger van nul tot ongeveer 50 pl. Houd de staart zacht en stevig in de buurt van de tip om de staart recht gehele monstername houden. Zorg ervoor dat de bloedstroom niet wordt afgesloten door een te strakke grip. Langzaam steek de katheter in de ader onder een kleine hoek van ongeveer 5 cm vanaf de punt van de staart. Als de ader is doorgedrongen, zal bloed vloeien in de katheter. Trekken langzaam de zuiger van de spuit om het gewenste volume bij een constante snelheid te verzamelen (~ 20 ul per sec). Raadpleeg de veterinaire personeel voor informatie over de maximale bloed volume dat kan worden verzameld. De maximale hoeveelheid bloed die moeten worden verzameld is afhankelijk van het gewicht en de gezondheidstoestand van de rat. Niet trekken meer dan 15% van het totale volume bloed in een periode van 14 dagen. Opmerking: Bloed is veel moeilijker te verzamelen van dieren die acuut werden benadrukt in de minuten voorafgaand aan de collectie proeven omdat stresshormonen vernauwen de bloedvaten. Bijvoorbeeld: door de rat kooi op een nieuwe kamer, waarbij een aantal minuten aan het dier of herhaalde insertie van de catheter verpakken in een ader zijn waarschijnlijk een acute stressreactie veroorzaken. Vergemakkelijken blood stroom door 'melken' de ader. Voer een vinger langs de lengte van de ader van de basis naar de punt van de staart, maar nog meer dan 2 cm vanaf de punt van de ingebrachte naald of de katheter kan losraken van de ader worden. Als het bloed niet met succes kan worden verzameld uit de eerste plaats van de katheter penetratie, opnieuw steek de naald verder de ader. Als er bloed werd verzameld op de eerste plaats, opnieuw onder druk van de naald door het loskoppelen en vervolgens weer aansluiten van de katheter en de injectiespuit voorafgaand aan de re-integratie in de ader. In het algemeen, vermijd extra penetraties. Zoals meerdere penetraties staartader instorting, waarbij de bloedtoevoer naar de staart wordt afgesneden en het zachte staart weefsel raakt necrotized kan veroorzaken, euthanaseren de rat als er staartader instorten. Wanneer adequaat monster volume wordt verzameld, laat de druk in de spuit door het loskoppelen en opnieuw aansluiten van de katheter. Zuig licht via de zuigerstang (~ 50 & #181; l), en de naald uit de ader te trekken. Let op: Als de naald wordt ingetrokken zonder eerst de druk vrijgeven in de spuit, zal bloed druppelen van de naald. Kort druk uitoefenen op de plaats van inbrengen om het bloeden te stoppen, en veeg het gebied met antiseptische oplossing. Zet de rat aan zijn kooi. 3. Verwerking Het bloedmonster Zuig lucht om ervoor te zorgen geen bloed blijft in de katheter naald, en gebruik een schaar om de katheter buis te snijden net boven de naald. Verdrijf het bloed in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis. Opmerking: Als er bloed wordt geduwd door de naald, kan de afschuifkracht rode bloedcellen veroorzaken scheuren die kunnen interfereren met vele downstream assays. Verwijder de naald om hemolyse te vermijden. Verzamelen bloedplasma, gebruik buizen die EDTA bevatten als antistollingsmiddel (hier gebruikt 10 pl 0,1 M EDTA 200-400 gl bloed, waarborgen de concentratie van EDTA die niet interfereert wet de downstream-test) en plaats op ijs. Spin volbloedmonsters bij 2100 xg in een gekoelde centrifuge (4 ° C) gedurende 10 min op 10 min verzameld. Elueer het plasma, het vermijden van verstoring van de rode en witte bloedcellen lagen. Om bloedserum, plaats monsters (zonder antistollingsmiddel) bij kamertemperatuur verzamelen tot 30 minuten om stolling te schakelen. Draai de verzamelbuizen in een gekoelde centrifuge (4 ° C) bij 2000 x g. Het serum kan vervolgens worden geëlueerd. Gebruik monsters direct, of op te slaan bij -80 ° C gedurende maximaal een jaar.