أخذ عينات الدم من الوريد الذيل الأفقي من الفئران
Summary
Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.
Abstract
Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.
Introduction
المؤشرات الحيوية التي تم الحصول عليها من دم توفر المفيد التشخيص، التنبؤية، وتقسيمها التدابير في سياقات السريرية عديدة، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية 1، علوم السرطان 2، والمرض النفسي 3. أنها يمكن أن تستخدم أيضا في مجال العلوم الأساسية لتقييم "الدولة" للكائن الحي، بما في ذلك درجة من الجوع، والتهاب، أو الإجهاد الحاضر. يمكن أن تتأثر هذه التدابير من قبل المتغيرات التي قد تكون أو لا تكون حاسمة لمسألة الفائدة، بما في ذلك الوقت من اليوم الذي يتم الحصول على العينة ونوع الجنس من الموضوعات. ويمكن أيضا أن تتأثر من قبل الاجهاد الناجم خلال إجراءات أخذ عينات الدم نفسها. يمكن أن هرمونات التوتر والشعور بالألم يغير بسرعة تكوين الدم.
القوارض هي الحيوانات المختبرية الأكثر شيوعا، ولقد تم تطوير أساليب متعددة لجمع الدم. الأسلوب الأمثل لأخذ عينات الدم يجب أن يكون الحد الأدنى الفيزيولوجيتأثير لتر على الحيوان، لا تحتاج إلى تخدير، والسماح أخذ العينات سريعة ومتكررة، وتوفير حجم الدم الكافي للعديد من التطبيقات المصب. تقنيات شعبية لجمع الدم مثل قسطرة للحبل الوريد أو بتر ذيل طرف لا تلبي هذه المعايير.
والهدف من هذا البروتوكول هو لوصف تقنية اخذ عينات من الدم لاستخدامها في الفئران التي هي مرهقة الحد الأدنى، لا تتطلب التخدير، ويسمح لمجموعات الدم متعددة ضمن موضوع واحد، ويوفر حجم عينة كبيرة نسبيا بحيث فحوصات متعددة يمكن أداؤها على عينة واحدة. والهدف من هذه الطريقة هو الحصول على عينات الدم التي تتأثر الحد الأدنى من الاستجابة للضغط النفسي الحاد.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف الإجراء سريع وبسيط للحصول على عينة من الدم من الفئران التي تقدم مزايا هامة على التقنيات الأخرى المستخدمة بشكل شائع. أولا، أنها لا تتطلب التخدير، على النقيض من أخذ العينات من حبل الوريد أو الجيوب الأنفية retroorbital. عندما يتم جمع عينات الدم المحيطة الإجراءات السلوكية، إدارة التخدير غير مرغوب فيها لأنها يمكن أن تتداخل مع التعلم والذاكرة 4،5. ثانيا، لأنه يتيح القدرة على جمع كميات أكبر من الدم تقنيات بزل الوريد أخرى، مثل جمع من الأوردة دواسة الصافن أو الظهرية. باستخدام تقنية الموضحة هنا، ما يصل الى 1.5 مل من الدم يمكن جمعها من الفئران عند نقطة زمنية واحدة، وبلغ حجم التداول الذي يسمح بسهولة فحوصات متعددة ليتم تشغيلها في نفس الوقت. أخيرا، هذا الإجراء يقلل من احتمال حدوث ضرر الأنسجة مقارنة بتر ذيل طرف أو نزيف retroorbital. استخدام هذا الإجراء يسهل الامتثال لW الحيوانقانون elfare ودليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، والتي تتطلب التقليل من الألم والمعاناة التي تنجم عن الإجراءات المخبرية التي أجريت على الحيوانات.
فمن المستحسن أن المحققين جديد إلى هذا الأسلوب ممارسة أساليب ضبط النفس والذيل النزيف من أجل تقليل الوقت الذي يتم تقييد حيوانات التجارب. الدم التي تم جمعها في أقل من 3 دقائق من بدء ضبط النفس ويوفر أفضل النتائج.
بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لأخذ عينات 1-4 مرات في الأسبوع، ولكن ليس أكثر من مرتين في اليوم الواحد. بينما مجموعات الدم المتكرر يمكن القيام بها، ومواقع أخذ العينات المختلفة تتحرك صعودا من قاعدة الذيل يجب استخدام، ويجب أن يكون بالتناوب الأوردة ذيل اليسار واليمين كمواقع أخذ العينات. حجم الدم الكلي من القوارض 6-7٪ من وزن الجسم، ويجب أن تجمع ما لا يزيد عن 15٪ من حجم الدم الكلي خلال فترة أسبوع 2. مصل الدمأو يضم البلازما حوالي 40-60٪ من حجم العينة التي تم جمعها.
اخذ عينات من الدم عبر الأوردة الذيل الأفقي ويمكن أيضا أن يؤديها في الماوس كما هو موضح هنا مع بعض التعديلات الطفيفة. أولا، يمكن استخدام مقياس صغير فقط (27 G) القسطرة. الثانية، فمن المستحسن استخدام رادع أنبوب، بدلا من التفاف، لشل حركة الفئران. حجم الدم التي يمكن الحصول عليها من الماوس باستخدام بزل الوريد من حزمة الأوعية الدموية تحت الفك السفلي (200-500 ميكرولتر) أكبر مما يمكن جمعها بأمان من الوريد ذيل (200 ميكرولتر كحد أقصى). لأن أخذ عينات الدم من الحزمة الوعائية تحت الفك السفلي يتطلب الحد الأدنى من ضبط النفس وربما تسفر عن المزيد من الدم، وهذا هو الطريق المفضل لأخذ العينات في الماوس.
والسرعة التي قد يتم تنفيذ هذا الإجراء، جنبا إلى جنب مع طبيعته الغازية الحد الأدنى، كما يقلل من الاضطراب المحتملة للتدابير القائمة على الدم عن طريق الاستجابة للضغط النفسي الحاد 6. الالاستجابة للضغط النفسي الحاد يمكن أن يغير مستويات تداول العديد من الجزيئات، بما في ذلك المحفزة وغيرها من عوامل المناعة النشطة 7، الهرمونات من محور الغدة النخامية، الغدة الكظرية 8، الهرمونات في الجهاز العصبي الودي 9، جريلين 10، الأفيونيات الذاتية 11، الدوبامين، و السيروتونين 12. وإذا رغبت يستريح تعميم تدابير من هذه الجزيئات أو غيرها التي تنظمها هذه الجزيئات، فمن المهم للحد من الاستجابة للضغط النفسي، والتي يتم تشغيلها ضمن اقل من دقيقة من بداية التعرض للإجهاد.
استجابات التوتر لا يغير فقط في تكوين الدم، ولكن أيضا تمثل عقبة فنية لأخذ عينات الدم بسبب انقباض الأوعية الدموية عن طريق زيادة الدافع من الجهاز العصبي الودي. يصبح من الصعب الحصول على زيادة تدفق الدم ثابتا من الفئران التي شن الاستجابة للضغط النفسي الحاد. لذلك، يجب أن تكون الشدة الحيوان قطرةأوتوماتيكية من أجل الحصول بسرعة العينات التي تعكس الحالة الفسيولوجية للاهتمام.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر فرجينيا دوهرتي وJunmei ياو لتقديم المساعدة التقنية. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل NIMH (R01 MH084966)، ومكتب أبحاث الجيش الأمريكي وكالة مشاريع أبحاث الدفاع المتقدمة (منح W911NF-10-1-0059) إلى KAG.
Materials
| Sodium heparin (1000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor Rinse-Chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, .75" width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
- Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction. Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).
- Shah, R., et al. Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).
- Chan, M. K., et al. Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders. Prog Neurobiol. , (2014).
- Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents. PLoS One. 7 (12), e51431 (2012).
- Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats. Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).
- Vahl, T. P., et al. Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).
- Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress. Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).
- McEwen, B. S. Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators. Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).
- Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress. Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).
- Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear. Mol Psychiatry. , (2013).
- Knoll, A. T., Carlezon, W. A. Dynorphin, stress, and depression. Brain Res. 1314 (56-73), (2010).
- Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder. Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).
