Высокочастотный ультразвуковой визуализации мыши шейных лимфатических узлов
Summary
Этот протокол описывает применение высокочастотного ультразвука (HFUS) для визуализации мыши шейных лимфатических узлов. Этот метод оптимизирует визуализацию и количественную шейки морфологии лимфатических узлов, объема и кровотока. Изображение биопсия шейки матки лимфатических узлов и лимфатических обработки ткани для гистологического исследования также показали,.
Abstract
Высокочастотный ультразвуковой (HFUS) широко используется в качестве неинвазивного метода визуализации для внутренних анатомических структур в экспериментальных малых систем животных. HFUS имеет способность обнаруживать структуры, как малые, как 30 мкм, имущество, которое было использовано для визуализации поверхностных лимфатических узлов у грызунов в яркости (B) -Режим. Сочетание мощности доплеровского с изображения в В-режиме позволяет для измерения кровообращения кровоток внутри лимфатических узлов и других органов. В то время как HFUS была использована для визуализации лимфатических узлов в ряде модельных систем мыши, не сообщалось Подробный протокол описания HFUS изображений и характеристику шейных лимфатических узлов у мышей. Здесь показано, что HFUS может быть выполнен с возможностью обнаружения и характеризуют шейных лимфатических узлов у мышей. В сочетании в В-режиме и мощность допплерографии может быть использован для обнаружения увеличения кровотока в иммунологически увеличенных шейных узлов. Мы также не описывают использование изображений в В-режиме, чтобы провести тонкую иглу биопсии шейки лимфы нетде, чтобы получить лимфатической ткани для гистологического анализа. Наконец, программное обеспечение автоматизированного шаги описаны для расчета изменения в лимфатических узлов и объема визуализировать изменения в лимфатических узлов морфологии следующие реконструкции изображения. Возможность визуально контролировать изменения в шейном биологии лимфатических узлов в течение долгого времени обеспечивает простую и мощную технику для неинвазивного мониторинга шейки изменений лимфатических узлов в доклинических моделях мыши болезни полости рта полости.
Introduction
Лимфодренаж из межклеточной жидкости ткани является основным методом распространения инфекционных микроорганизмов и раковых, возникающих в челюстно-лицевой области 1,2. Клиническая оценка шейных лимфатических узлов является общей практикой диагностики используется для определения наличия или прогрессирования заболеваний, которые возникают в ротовой полости. Это подчеркивает важность сбора шейных лимфатических узлов, как ценные анатомических участков для диагностики заболеваний полости рта 3. Несколько специализированных методик визуализации клинически используется для идентификации больные шейные лимфатические узлы. Они включают в себя позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), компьютерной томографии (КТ) и магнитно-резонансной томографии (МРТ). В то время как очень ценный, все эти методы требуют тщательной подготовки пациента, высоко специализированное оборудование и / или химического настой в обращение, чтобы включить или усилить процесс формирования изображения.
Ультразвуковое исследование (УЗИ; США) является широко применяется метод, используемый для имвозраст шейные лимфатические узлы, представляющие с лимфаденопатией из-за инфекции или метастатического поражения 4-6. США часто сочетается с ПЭТ-КТ и МРТ, чтобы обеспечить всестороннее представление пациента лимфатических узлов статуса, помогая определить постановку опухоли и необходимость хирургического иссечения 7. Неинвазивный характер США также имеет свои достоинства по сравнению с другими методами визуализации, в том числе простота использования, низкая стоимость, минимальным дискомфортом для пациента и подготовки. Поверхностные подкожные расположение большинства шейных лимфатических узлов позволяет США вести минимально инвазивных тонкоигольная аспирационная биопсия с повышенной точностью, улучшение диагностической точности 8.
Коммерческая высокочастотный (ВЧ) США предоставляет подробную разрешение внутренних анатомических структур до 30 мкм 9. Использование преобразователей в диапазоне от 22-70 МГц, HFUS был легко применены к различных экспериментальных систем грызунов, чтобы в реальном времени изображений внутренних органов в живом организме.; HFUS была адаптирована для визуализации образования опухоли в обычной яркости (В) -Режим, а также с рядом общих и специализированных усиления контраста agents9. Использование энергетического допплера с HFUS предоставляет возможность контролировать кровоток в опухоли мыши, что позволяет комплексную оценку ангиогенной перфузии в живом мышей 10,11. HFUS был использован для визуализации больные мыши лимфатические узлы в пределах главного полости тела, демонстрируя параллельный полезность этой технологии в клинической практике. В частности, воспалительных и метастатических лимфоузлов висцерального изменений были обнаружены в мышиных моделях рака молочной железы, несущим 12,13 поджелудочной 14, колоректальный 15 и 16 легких опухолей, а также волокнистые histocytomas 17 и выдержанный мыши модель приобретенного гидронефрозе 18 , Эти примеры затвердеть значение HFUS как мощный инструмент для следственной индуцированного опухолью лимфатических узлов в самых разнообразных ровмятина системы.
Некоторые модели бактериальной инфекции 19,20 головы и шеи плоскоклеточного рака клеток (ПРГШ) 21,22 были разработаны для изучения этих болезней в доклинической обстановке. В отличие от человека, мышей содержат три шейные лимфатические узлы, которые опроса лимфы от тканей полости рта (нижней челюсти, нижней челюсти и подчелюстной околоушной поверхностного 23). Недавно мы сообщали, использование HFUS на карту расположение и морфологию этих лимфатических узлов, мониторинга изменений в лимфатических узлов и объема кровотока в канцероген-индуцированного мышиной модели ПРГШ 24. Здесь мы предоставляем подробный протокол для использования HFUS для выявления, визуализации и анализа шейные лимфатические узлы в живых мышей. Этот протокол также демонстрирует возможность использования HFUS провести Image- руководствуясь тонкой иглой биопсии увеличенный мыши шейных лимфатических узлов, что позволяет гистологическое мониторинг изменений в шейных лимфатических узлов содержания и патологий более тIME в том же животного. Этот протокол можно легко приспособить для обеспечения детального изучения шейки матки патологии лимфатических узлов полученных от любого инвазивного заболевания полости рта полости у мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный протокол позволяет для визуализации и оценки в месте мышиных шейных лимфатических узлов, использующих неинвазивные изображений HFUS. Использование B-режиме и мощности доплеровского изображения для визуализации шейки морфология лимфатических узлов, объем и лимфатических узлов кровотока предусматривает экспериментального анализа доклинических модельных систем, аналогичных мыши, которая используется для характеристики цервикальной узлов пациентов в клинической практике. Способность контролировать cervial лимфатические узлы через биопсии тонкой также предоставляет полезную технику для обнаружения изменений иммунных клеток и присутствие иностранных типов клеток или бактерий во полости рта болезни, вызванной лимфаденопатий у мышей. Простота использования и низкой стоимости, связанной с HFUS позволяет быстрого скрининга шейки лимфоузлов в самых разнообразных животных моделях.
Важным шагом в этом протоколе является начальной успешной идентификации шейных лимфатических узлов в HFUS изображений. Наш объект имеет ассортимент HFUS Транsducers как описано, так что мы использовали их, чтобы получить высокое качество изображения. Однако, если мы описываем преобразователи недоступны, то можно адаптировать изображение, используя другие датчики. Для этого, регулируя глубину и ширину изображения, чтобы получить адекватный образ это все, что требуется. Разрешение таких изображений может варьироваться, но она по-прежнему должна быть возможность получить высокое качество изображения с помощью HFUS. Визуализации ориентиры полости рта и щитовидной железы значительно помочь в ориентации пользователя на соответствующую область, где лимфатические узлы локализованы. Характерной овальной формы, гипоэхогенной природа и поверхностным расположение близко к поверхности кожи позволяет быстро подтверждающего идентификации шейных лимфатических узлов пределы правильного участка шеи. В то время как все три узла могут быть видны в одной плоскости изображения (рис 3B), как правило, один или два узла в плен во время съемки. Незначительные корректировки положения датчика может быть проведена раздиратьER отличается визуализации плоскостей видно, что позволяет визуализировать все узлы на одной стороне шеи.
В то время как мы нашли описанный метод надежного выявления шейные лимфатические узлы, существуют специфические ограничения на методики визуализации и биопсии. Поверхностный характер мыши шейных лимфатических узлов дает чрезмерное мобильность, когда даже небольшое давление прикладывают к коже при помощи датчика головы. Это может быть нейтрализована медленно применением датчика голову в ультразвуковой гель на шее мышей, пока знаковые изображения не идентифицированы. Лимфатических узлов мобильность может также усложнить мелкий биопсии, особенно при использовании преобразователей в более высоком разрешении (50 МГц) диапазона. По центру изображения лимфатических узлов для биопсии, как правило, вытеснены из поля зрения из-за силы биопсии иглой, необходимого для прокола кожи над и капсулы. Это может быть исправлено с помощью нецентральной позиционирования лимфатического узла в направлении вступления иглы,обеспечивая пространство для лимфатического узла для толкания по но все еще остаются в поле зрения во время биопсии. По нашему опыту, лимфатических узлов> 10 мм 3, очень трудно биопсии, и часто толкает иглу, а не проникла во продвижению иглы. Таким образом, биопсия лучше использовать для увеличенных лимфатических узлов, где размер> 10 мм 3 для обеспечения достаточного размера целевой узел и стабильности в шейном отделе. Кроме того, биопсия материал может не содержать достаточное количество клеток для процедур, где большее число ячеек, необходимых (например, проточной цитометрии).
HFUS был использован успешно визуализировать ортотопическая ПРГШ опухоли 25, и имеет потенциал, чтобы контролировать шейки метастазы узла у мышей с опухолями полости рта 24. В дополнение к УЗИ, томография биолюминесценции также использоваться для визуализации ортотопическая устное образование опухоли и рак шейки лимфатических узлов метастазы в живых мышей 26,27. Как Alternтельный подход, изображений биолюминесценции имеет явное преимущество над HFUS в состоянии непосредственно количественно прогрессирование опухоли и метастазов бремя в течение долгого времени в то же животное. В то время как несомненно полезно, изображений биолюминесценции не может измерить многие параметры, визуализированных с помощью HFUS, в том числе лимфатических узлов морфологии, узловых объемов или кровотока. Изображений биолюминесценции также требует специализированных темные коробки, чтобы сохранить мышей во время съемки, делая эту технику непригодной для адаптации для тонкой биопсии.
Кроме того, изображения биолюминесценции требуется производство опухолевых клеток, которые стабильно выразить люциферазы фермент, позволяя эту технику, чтобы использовать только в случае ортотопической ксенотрансплантатов с люциферазы трансфецированных клеток опухоли в ослабленным иммунитетом мышей, или с индуцируемых ткане-специфических трансгенных систем, которые ограничивают экспрессию люциферазы в пространственно-временной форме конкретного к ткани опухоли происхождения. В отличие от этого, может быть HFUS UСЭД в сочетании с биолюминесценции изображений в этих моделях, а также способен визуализации шейные лимфатические узлы в моделях канцероген-индуцированного устных опухолей у мышей с полным иммунитетом 28,29. В то время как HFUS может быть более гибкой, для большинства моделей мыши рака полости рта, в сочетании информации, которая может быть получена из биолюминесценции и HFUS изображений в системах, где опухолевые клетки экспрессируют люциферазы может обеспечить более полную картину шейки лимфатических узлов, чем любой модальности изображений только.
Способность идентифицировать и выявить мыши шейные лимфатические узлы в режиме реального времени позволяет этот метод будет использоваться в большинстве моделей заболеваний полости рта, что приводит к воспалительным лимфаденопатией, где животное может быть сохранена в перевернутом положении под краткосрочной анестезии. Обнаружение метастазов в лимфатических узлах или бактериальной инфекцией и сопутствующей воздействия на морфологии лимфатических узлов у животных представляет собой значительное преимущество по сравнению с традиционными методамикоторые требуют лимфатические узлы должны быть удалены из мертвых животных для гистологического исследования. Сочетание HFUS с тонкой биопсии позволяет средства для проведения рутинного патологический анализ шейных лимфатических узлов, аналогичных тому, что проводится в клинике, обеспечивая улучшенный способ мониторинга прогрессирования заболевания в большинстве текущих мышиных моделях заболеваний полости рта.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Дороти Д. Рэдфорд фонда пожертвований от университета Мэри Babb Рэндольф онкологического центра Западной Вирджинии. Использование Модели и изображений Университет Западной Вирджинии за животными (AMIF) и микроскопии изображений Facility (MIF) (при поддержке Марии Бабб Рэндольф онкологического центра и NIH гранты P20 RR16440, P30 RR032138 / GM103488 и S10 RR026378) выражает искреннюю признательность.
Materials
| Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11945 | |
| Power Dopper Mode and 3D Mode | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11952; VS-11484 | |
| Vevo compact anesthesia system | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | ||
| Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | SA-11983 | |
| Thermasonic Gel Warmer | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | Optional | |
| Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz – 55 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11960 | Referred to as 40 MHz Transducer |
| Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz – 70 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-12026 | Referred to as 50 MHz Transducer |
| Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-1663 | |
| Electrode gel | Parker Laboratories | 174-1525 | |
| Tape | Medical Arts Press | 174-153000 | |
| Depilatory Cream | Carter Products | ||
| Cotton swabs | General Supply | ||
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-907 | |
| Water | General Supply | ||
| Lubricating gel | Parker Laboratories | 57-05 | |
| Ultrasound gel | Parker Laboratories | 01-50 | |
| Microcentrifuge tube rack | General Supply | Used to raise mouse platform for optimal biopsy position | |
| 27G ½ inch needle with 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| ThinPrep PreservCyt Solution | Hologic | 70097-002 | Refered to as biopsy media |
| Microcentrifuge tubes | General Supply | ||
| Thinprep 2000 processor | Cytyc, Marlborough, MA | Blue Filter | |
| Olympus AX70 Provis Microscope | Olympus, Center Valley, PA |
References
- Montone, K. T. Infectious diseases of the head and neck: a review. Am J Clin Pathol. 128 (1), 35-67 (2007).
- Bryson, T. C., Shah, G. V., Srinivasan, A., Mukherji, S. K. Cervical lymph node evaluation and diagnosis. Otolaryngol Clin North Am. 45 (6), 1363-1383 (2012).
- Joshi, P. S., Pol, J., Sudesh, A. S. Ultrasonography – A diagnostic modality for oral and maxillofacial diseases. Contemp Clin Dent. 5 (3), 345-351 (2014).
- Oz, F., et al. Evaluation of clinical and sonographic features in 55 children with tularemia. Vector Borne Zoonotic Dis. 14 (8), 571-575 (2014).
- Niedzielska, G., Kotowski, M., Niedzielski, A., Dybiec, E., Wieczorek, P. Cervical lymphadenopathy in children–incidence and diagnostic management. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 71 (1), 51-56 (2007).
- Ying, M., Bhatia, K. S., Lee, Y. P., Yuen, H. Y., Ahuja, A. T. Review of ultrasonography of malignant neck nodes: greyscale, Doppler, contrast enhancement and elastography. Cancer Imaging. 13 (4), 658-669 (2013).
- Stoeckli, S. J., et al. Initial staging of the neck in head and neck squamous cell carcinoma: a comparison of CT, PET/CT, and ultrasound-guided fine-needle aspiration cytology. Head Neck. 34 (4), 469-476 (2012).
- Rottey, S., et al. Evaluation of metastatic lymph nodes in head and neck cancer: a comparative study between palpation, ultrasonography, ultrasound-guided fine needle aspiration cytology and computed tomography. Acta Clin Belg. 61 (5), 236-241 (2006).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Chen, J. J., Fu, S. Y., Chiang, C. S., Hong, J. H., Yeh, C. K. Characterization of tumor vasculature distributions in central and peripheral regions based on Doppler ultrasound. Med Phys. 39 (12), 7490-7498 (2012).
- El Kaffas, A., Giles, A., Czarnota, G. J. Dose-dependent response of tumor vasculature to radiation therapy in combination with Sunitinib depicted by three- dimensional high-frequency power Doppler ultrasound. Angiogenesis. 16 (2), 443-454 (2013).
- Bachawal, V. S. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Res. 73 (6), 1689-1698 (2013).
- Loveless, M. E., et al. A method for assessing the microvasculature in a murine tumor model using contrast-enhanced ultrasonography. J Ultrasound Med. 27, 12-1699 (2008).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Kodama, T., et al. Volumetric and angiogenic evaluation of antitumor effects with acoustic liposome and high-frequency ultrasound. Cancer Res. 71 (22), 6957-6964 (2011).
- Hwang, M., Hariri, G., Lyshchik, A., Hallahan, D. E., Fleischer, A. C. Correlation of quantified contrast-enhanced sonography with in vivo tumor response. J Ultrasound Med. 29 (4), 597-607 (2010).
- Li, L., Mori, S., Sakamoto, M., Takahashi, S., Kodama, T. Mouse model of lymph node metastasis via afferent lymphatic vessels for development of imaging modalities. PLoS One. 8 (2), e55797 (2013).
- Springer, D. A., et al. Investigation and identification of etiologies involved in the development of acquired hydronephrosis in aged laboratory mice with the use of high-frequency ultrasound imaging. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 4, (2014).
- Papadopoulos, G., et al. A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites. J Vis Exp. (90), (2014).
- Vulcano, A. B., et al. Oral infection with enteropathogenic Escherichia coli triggers immune response and intestinal histological alterations in mice selected for their minimal acute inflammatory responses. Microbiol Immunol. 58 (6), 352-359 (2014).
- Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N., Fidler, I. J. An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res. 8 (1), 293-298 (2002).
- Kanojia, D., Vaidya, M. M. 4-nitroquinoline-1-oxide induced experimental oral carcinogenesis. Oral Oncol. 42 (7), 655-667 (2006).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312 (1-2), 12-29 (2006).
- Walk, E. L., McLaughlin, S., Coad, J., Weed, S. A. Use of high frequency ultrasound to monitor cervical lymph node alterations in mice. PLoS One. 9 (6), e100185 (2014).
- Pezold, J. C., Zinn, K., Talbert, M. A., Desmond, R., Rosenthal, E. L. Validation of ultrasonography to evaluate murine orthotopic oral cavity tumors. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 68 (3), 159-163 (2006).
- Sano, D., Myers, J. N. Metastasis of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Cancer Metastasis Rev. 26 (3-4), 645-662 (2007).
- Sano, D., et al. The effect of combination anti-endothelial growth factor receptor and anti-vascular endothelial growth factor receptor 2 targeted therapy on lymph node metastasis: a study in an orthotopic nude mouse model of squamous cell carcinoma of the oral tongue. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135 (4), 411-420 (2009).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clin Cancer Res. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vitale-Cross, L., et al. Chemical carcinogenesis models for evaluating molecular- targeted prevention and treatment of oral cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2, 419-422 (2009).
