Haute fréquence imagerie par ultrasons de souris cervicales ganglions lymphatiques

Toutes les procédures animales démontré dans ce protocole ont été examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation de l'Université West Virginia en vertu des protocoles 11-0412 et 14-0514 et menées en conformité avec les principes et les procédures décrites dans le Guide du NIH pour le soin et l'utilisation des animaux. 1. Préparation d'un animal Anesthésier une seule souris dans une chambre d'induction en utilisant 3% isofluorane mélangé avec 1,5 L / min 100% d'oxygène. Retirer l'animal de la chambre de l'induction et la place dans une position couchée sur la plate-forme d'imagerie préchauffé à 40 ° C et maintenue entre 37-42 ° C (figure 2A). Confirmez l'anesthésie par l'absence de réponse à un pincement de l'orteil. Positionner le museau de la souris dans la coiffe reliée au système d'anesthésie. Appliquer l'anesthésie pour maintenir la sédation de l'état d'équilibre (1,5% de isofluorane mélangé avec 1,5 L / min 100% d'oxygène). Appliquer du lubrifiant de l'œil chaque œil pour empêcher Drying. Appliquer le gel de l'électrode pour les électrodes et utilisez du ruban pour fixer chacune des quatre pattes à l'électrode correspondante. Les plots d'électrodes ECG se transmettre de l'animal dans le système de formation d'image pour permettre la surveillance de la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire. Graisser et insérer la sonde de température rectale pour la surveillance continue de la température corporelle. La température normale du corps de la souris est de 36,9 ° C. 1-2 ° C variation est normale, tandis que sous anesthésie. Utiliser une crème dépilatoire pour enlever la fourrure du col de la souris. Rincer la région du cou avec de la gaze imbibée d'eau pour enlever les poils et l'excès de crème dépilatoire. Eventuellement, utiliser l'application supplémentaire de crème dépilatoire pour enlever tous les poils du corps restant (figure 2B). 2. Identification et Image Acquisition du col de l'utérus de souris ganglions lymphatiques Utilisation HFU Pour commencer, appliquer une couche de gel d'ultrasons réchauffé à la région du cou dépourvu de fourrure. Utilisez application libérale de gel pour une image optimalequalité (figure 2C). Éviter d'introduire des bulles d'air dans le gel lors de l'application, ce qui peut interférer avec l'imagerie par ultrasons. Ajustez la plate-forme d'imagerie 20-30 ° de sorte que la souris est positionné avec la tête légèrement surélevée. Cette position permet de garantir le taux de respiration optimale pour la souris. Placez le transducteur de 40 MHz transversalement dans le système de montage avec soin et l'abaisser jusqu'à ce que l'avant de la tête de balayage de transducteur est immergé dans le gel à ultrasons (Figure 2C). NOTE: Assurez-vous de ne pas mettre une pression excessive sur le col de la souris, car cela pourrait entraîner une détresse respiratoire excessive. En outre, il est utile pour l'imagerie d'avoir un tampon de gel entre le transducteur et la souris. Imagerie en mode B et de détection des ganglions lymphatiques: Utilisation de l'ordinateur qui commande le logiciel d'acquisition HFU, régler la luminosité (B-) Les réglages du mode des paramètres suivants: Gain de 22 dB, la profondeur 10.00mm, largeur 14,08 mm. NOTE: Ces paramètres sont un point de départ suggéré, et peuvent exiger un léger ajustement pour l'acquisition d'image optimale entre les différentes applications. Respecter les ganglions cervicaux normaux que les structures hypoéchogènes ovales près de la surface de la peau dans un champ hyperéchogène environnante. L'apparition de ganglions lymphatiques malades peuvent varier selon les modèles. Pour l'image systématiquement tous les ganglions lymphatiques dans la région du cou utiliser les étapes suivantes: Utilisez l'axe Y pour balayer le cou dans un crâne de manière caudale vers la région thoracique. Utilisez X-axe pour centrer l'image. Identifier les principaux points de repère: cavité buccale, de la langue et de la glande thyroïde (figures 3A, B et C; respectivement); incliner la plate-forme de formation d'image à régler horizontalement la surface ventrale du cou de la souris, ce qui rend les deux côtés du cou apparaissent même dans l'image B-mode. La quantité de basculement dépend de la physiologie de chaque souris individuelle. </li> Effectuer un balayage 3D de la région du cou ensemble de la région de la cavité / langue buccale à la glande thyroïde, afin de cartographier les ganglions lymphatiques et des monuments associés tout au long du cou. Localisez le / région de la cavité buccale de la langue (figure 3A) et notez l'emplacement numérique sur l'échelle Y. Localiser glande thyroïde (Figure 3C) et notez l'emplacement numérique sur l'échelle Y. Calculer la différence entre les valeurs obtenues en (2.4.1) et (2.4.2) à déterminer la longueur totale en mm de la zone de cou portant une image. Utilisez le bouton Y pour centrer le transducteur sur le point médian de la longueur totale déterminée. Appuyez sur "3D". Entrez la longueur totale. Pour la taille de l'étape 3D, utiliser 0,076 mm d'acquérir la pile de la série d'image pour la région du cou entier. Une fois la numérisation terminée, sélectionnez le côté droit ou gauche du cou et de centrer le transducteur sur un ganglion personne d'intérêt, puis relevez le 40 MHz transducteur de la souris. Retirez le transducteur de 40 MHz et le remplacer par un transducteur microscan 50 MHz (également dans une position transversale) pour obtenir des images haute résolution. Reconstituer le gel à ultrasons sur le goulot de la souris et abaisser le transducteur de 50 MHz dans le gel à ultrasons. 3D Alimentation imagerie Doppler Conduite 3D numérise avec une puissance Doppler pour ânes volume et la vascularisation des individuels ganglions cervicaux comme suit: Appuyez sur le bouton d'alimentation sur le clavier du système pour acquérir le pouvoir Dopper et ajuster les réglages de puissance en mode suivantes: PRF 4 KHz, Doppler gain de 34 dB, un gain de 30 dB 2D, profondeur 5,00 mm, largeur de 4,73 mm. NOTE: Comme précédemment, ces paramètres sont un point de départ suggéré et peut être modifié au besoin pour l'acquisition d'image optimale dans divers modèles. Localisez le plus crânienne-point de ganglion lymphatique d'intérêt et notez l'emplacement sur l'échelle Y. Localisez le point le plus caudale du même noeud et la notel'emplacement sur l'échelle Y. Calculez la différence de distance pour déterminer la longueur totale du ganglion lymphatique (voir l'étape 2.4.3). Centrer le transducteur sur le point médian de la longueur totale déterminée, en utilisant l'emplacement Y-échelle. Appuyez sur "3D" et entrez la longueur totale des ganglions lymphatiques. Utiliser 0,051 mm pour la taille de pas. Remarque: En raison de la proximité du transducteur à la région de la poitrine, le transducteur de 50 MHz peut donner lieu à une image Doppler instable en raison de la détection de mouvement respiratoire normal. Cela peut être éliminé en utilisant l'option "Respiration Gating" disponible sous l'onglet "physiologique". Entourez le ganglion lymphatique sélectionné avec la boîte jaune qui désigne la région à être analysés par Doppler puissance et sélectionnez "scan 3D" pour acquérir des images. Soulever le transducteur hors de la souris et le déplacer vers le côté opposé du goulot. Abaisser le transducteur sur la souris et répétez les étapes décrites ci-dessus pour image ganglions lymphatiques de ce côté du cou. Enregistrer ensembles d'image pour une analyse ultérieure. 3. biopsie du ganglion cervical Sélectionner le ganglion lymphatique souhaitée pour la biopsie et maintenir l'imagerie par HFU avec le transducteur de 50 MHz. Chose la plus importante ganglion lymphatique cervical visible de chaque côté du col de la souris. Hypertrophie des ganglions lymphatiques indique généralement une réponse inflammatoire, et donc ces nœuds sont des candidats idéaux pour une biopsie. NOTE: Nous avons trouvé qu'il est très difficile de procéder à des biopsies sur ganglions cervicaux inférieure à 10 mm 3. Préparer l'aiguille et la seringue pour biopsie en plaçant une seringue de 1 ml avec une aiguille de 0,5 pouces 27 G ci-joint dans le porte-seringue. Ajuster le porte-aiguille pour orienter l'aiguille 90 ° par rapport au col de la souris (figure 4A). Préparer par élévation de la plate-forme entière de la souris au niveau de l'aiguille. Atteindre cet objectif en retirant le moteur 3D et le passage à un plus grand PlatORM, ou en plaçant un objet solide de hauteur convenable sous la plate-forme courte fourni. Utiliser un portoir de tubes de microcentrifugeuse en plastique à cet effet. Si nécessaire, faire tourner la plate-forme de 180 ° afin de biopsie noeuds situés sur le côté opposé du col de l'appareil d'aiguille. Réglez les paramètres d'acquisition en sélectionnant «Préférences», puis en choisissant "Max & tampon élargie". Agrandir le champ de vision jusqu'à une profondeur de 8,00 mm et une largeur de 9,73 mm. Tournez sur le guide de l'aiguille en utilisant l'écran touches d'appel. Le guide d'aiguille prédire la trajectoire de l'aiguille sur l'écran et permet à l'utilisateur d'aligner le ganglion lymphatique d'intérêt dans l'emplacement correct pour une biopsie. Assurez-vous que le ganglion lymphatique reste constamment en vue, en centrant le ganglion lymphatique au milieu ou légèrement à gauche du centre de l'écran (figure 4B). Pour obtenir la boucle ciné ensemble de la procédure, appuyez sur pré-déclenchement sur le clavier du système avant de commencer la biopsie. Régler le support de l'aiguille jusqu'à ce que la pointe de l'aiguille est en vue et les contacts de la peau (figure 4B). Avancer l'aiguille avec une entreprise, pousser vite pour perforer la peau. Continuer à avancer l'aiguille jusqu'à la pointe perfore également la capsule (figure 4C) et est visible dans la moelle (figure 4D). Une fois que l'aiguille est correctement situé dans le noeud, tirez doucement sur ​​le piston de la seringue dos entre les démarcations 200-300 pi de procéder à la biopsie (Figure 4D et 4E). Notez que matériau de biopsie est typiquement pas visible à l'intérieur de la seringue. Retirez délicatement l'aiguille du cou de la souris. Expulser le contenu de la seringue dans un tube à microcentrifugation de 1,5 ml. Retirez l'aiguille de la seringue, laissant l'aiguille dans le tube. Prélever 1 ml de milieu de biopsie (à partir d'une aliquote, séparés de la source du stock) avec la même seringue, puis remettre en place l'aiguille à la seringue tout en gardant l'aiguille dans etube e. Rincer la seringue et l'aiguille avec les médias biopsie en expulsant les médias biopsie dans le tube. NOTE: Ne tirez pas sur le piston alors que l'aiguille est fixée à tout moment après la biopsie. Cela réduit le risque de perdre le matériau de biopsie raison de la petite taille de l'échantillon. Confirmez lymphatique contenu du nœud par des moyens histologiques (Figure 4F) et d'analyser par des méthodes supplémentaires (histochimie, la cytométrie en flux, etc.), le cas échéant. Une fois que la biopsie est terminée, éteignez l'anesthésie et retirer la sonde de température rectale. Retirer le gel échographique excès de la souris avec de la gaze et retirez le ruban adhésif de chaque patte. Retirer la souris à partir de la plate-forme de formation d'image et revenir à une cage. Saignement minime de site de biopsie peut se produire, mais cela arrête sans intervention. Surveiller la souris lors de la récupération jusqu'à ce que la pleine activité reprend. 4. Analyse d'image des ganglions lymphatiques cervicaux <li> Dans le logiciel de l'échographie, sélectionnez l'image pour l'analyse et accédez à l'onglet "Image Processing". Choisissez "Charger dans 3D". Sélectionnez "3D reconstruite Image" dans le coin supérieur gauche, en cliquant sur le bouton "Afficher Volet unique". Utilisez la fonction de zoom pour agrandir l'image, si désiré. Basculer "Disposition de l'affichage" pour afficher l'image que dans les modes B, qui élimine la superposition puissance Doppler de la vue. Il est ainsi plus facile de voir les bords du ganglion lymphatique au cours de l'analyse ultérieure en 3-D. Faire défiler la série d'images pour localiser le début du ganglion lymphatique. Pour circonscrire le ganglion lymphatique, accédez à l'onglet "Paramètres 3D". Sélectionnez "volume", puis sur le bouton "Démarrer" à côté de "parallèle". Dessiner les contours autour de la zone d'intérêt dans les images individuelles par défilement. Continuez jusqu'à ce que les images qui englobent l'ensemble des ganglions lymphatiques sont marqués. Choisissez "Terminer" pourcompléter l'analyse. Au bas de l'image, 3D% volume et la vascularisation est automatiquement affichée. REMARQUE: 3D volume correspond au volume des ganglions lymphatiques, et la vascularisation pour cent représente le pourcentage du ganglion lymphatique positif pour le flux sanguin par effet Doppler puissance. Basculer "Disposition de l'affichage" pour afficher l'imagerie Doppler puissance en surimpression sur l'image en mode B-. Sur le point de vue de surface observer une vue nette de la zone de volume d'intérêt. Exporter les images dans le fichier d'image (TIF) ou le format 3D scans marquées que les films (.avi) pour une utilisation ultérieure.