अलगाव और विभिन्न आयु Murine Thymic grafts के ट्रांसप्लांटेशन।
Summary
This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.
Abstract
Thymic चयन की प्रभावकारिता को विनियमित तंत्र है कि बीमार परिभाषित रहते हैं। विवो स्वयं और विदेशी एंटीजन के लिए विशेष टी कोशिकाओं के विकास और चयन के विश्लेषण में यहाँ प्रस्तुत विधि की अनुमति देता है। दृष्टिकोण immunodeficient SCID प्राप्तकर्ताओं में विभिन्न आयु वर्ग के चूहों से ली गई Thymic ग्राफ्ट का आरोपण जरूरत पर जोर देता। समय की एक अपेक्षाकृत कम अवधि में प्राप्तकर्ताओं को पूरी तरह प्रत्यारोपित थाइमस भ्रष्टाचार से व्युत्पन्न टी कोशिकाओं के साथ पुनर्गठन कर रहे हैं। केवल thymocytes अलगाव के समय में थाइमस बोने चयन से गुजरना और परिपक्व टी कोशिकाओं में विकसित। जैसे, उम्र पर निर्भर Thymic घटनाओं की एक समारोह के रूप में engrafted टी कोशिकाओं की प्रकृति और विशिष्टता में परिवर्तन का आकलन किया जा सकता है। तकनीकी विशेषज्ञता सफल Thymic प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक है, इस विधि में विवो न्यायपालिका Thymic समारोह और / या homeostas का एक परिणाम या के कारण हैं कि विकृतियों की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय रणनीति प्रदान करता हैहै।
Introduction
थाइमस टी सेल के विकास में महत्वपूर्ण घटनाओं 1 पाए जाते हैं जिसमें एक अंग है। निवासी thymocytes, टी सेल रिसेप्टर (TCR) α और β जीन की पुनर्व्यवस्था पर, थाइमस 2 के cortical और दिमाग़ी क्षेत्रों में lymphostromal और प्रतिजन पेश कोशिकाओं (एपीसी) के साथ बातचीत की एक श्रृंखला से गुजरना। Thymic सकारात्मक चयन मेजबान प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (MHC) वर्ग मैं और द्वितीय अणुओं 2-3 के संदर्भ में प्रतिजनी पेप्टाइड्स समझते हैं कि thymocytes का निर्माण करने के लिए cortical Thymic उपकला कोशिकाओं (टीईसी) द्वारा मध्यस्थता है। इसके बाद Thymic नकारात्मक चयन दिमाग़ी टीईसी या वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) MHC वर्ग मैं और द्वितीय अणुओं 3 से बंधे स्वयं प्रोटीन से प्राप्त होता है कि वर्तमान पेप्टाइड्स के साथ एक बातचीत के द्वारा संचालित autoreactive thymocytes के मिटाने, जरूरत पर जोर देता। इन प्रक्रियाओं के अंतिम परिणाम एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम परिपक्व सीडी 4 + और CD8 + टी कोशिकाओं का एक पूल की स्थापना हैविदेशी एंटीजन की आत्म प्रोटीन से 4 कम से कम जेट का प्रदर्शन करते हुए।
Thymic चयन घटनाओं की दक्षता Thymic परिपक्वता, मस्तिष्क और cortical टीईसी, Thymic डीसी के सबसेट रचना की आवृत्ति, और Thymic व्यापारियों 3 के स्रोत सहित कारकों की एक मेजबान से प्रभावित है। विशेष रूप से, न्यायपालिका Thymic चयन क्रमशः, बिगड़ा नकारात्मक या सकारात्मक चयन से पैदा होती है, जो स्व-प्रतिरक्षित 5 या immunodeficient विकृतियों, में परिणाम कर सकते हैं। Thymic चयन के विनियमन के आणविक घटनाओं, हालांकि, खराब समझ रहे हैं। इन विट्रो ऐसे reaggregate Thymic अंग संस्कृतियों (RTOC) के रूप में 6 दृष्टिकोण, Thymic चयन के साथ जुड़े बुनियादी घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी हो सकता है, लेकिन पूरी तरह से चल रही है की गतिशीलता पुनरावृत्ति करने में विफल साबित किया है विवो घटनाओं में। नतीजतन, इस Thymic प्रत्यारोपण आधारित दृष्टिकोण विवो 7 में बेहतर अध्ययन thymocyte चयन की घटनाओं के लिए स्थापित किया गया था </s> ऊपर।
इस प्रोटोकॉल immunodeficient SCID प्राप्तकर्ता चूहों में नवजात शिशु और वयस्क दाता चूहों से thymi रोपाई का वर्णन है। इस तकनीक को सकारात्मक और नकारात्मक Thymic चयन, साथ ही व्यक्तिवृत्त के दौरान विभिन्न टी सेल सबसेट के Thymic उत्पादन को नियंत्रित करने वाले तंत्र के अध्ययन के सभी देता है। सबसे हाल ही में, इस दृष्टिकोण Thymic चयन की दक्षता जल्दी autoreactive टी कोशिकाओं की वृद्धि की विकास के लिए अग्रणी चूहों में जन्म के बाद ही सीमित है कि प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और विदेशी एंटीजन 7 के लिए एक कम टी सेल प्रदर्शनों की सूची विशिष्ट दिया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).
Materials
| Ethanol | Decon Laboratories | 2705HC | |
| PBS | GIBCO | 14190-144 | pH 7.2 |
| Betadine Solution | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |
| Sutures (1.0 metric) | Ethicon | J493G | 18" (45cm) |
| AUTOCLIP Wound Clips (9mm) | Clay Adams® Brand | 427631 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | Sterile, disposable |
| Mouse anti-CD3 Ab | eBioscience | 11-0031-85 | Clone: 1452C11 |
| Mouse anti-CD4 Ab | eBioscience | 48-0042-82 | Clone: RM4-5 |
| Mouse anti-CD8 Ab | eBioscience | 25-0081-82 | Clone: 53-6.7 |
| Lancet | Medipoint | Goldenrod 4mm | |
| Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt | Invitrogen | P30253 | |
| 96-well round botton polypropylene plates | Corning | 3365 | |
| 1.2mL polypropylene cluster tubes | Corning | 4401 | |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | BD | 352002 | |
| 40uM Nylon Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Hazardous |
| Puralube Optical Ointment | Fisher Scientific | NC0138063 | |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5030 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430196 | 60mm x 15mm, Sterile |
References
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