투과성이 골격 근육 섬유에 의해 생성 된 최대 아이소 포스의 측정
Summary
화학적으로 피부 또는 투과성이 골격근 섬유의 수축 특성의 분석은 하나의 근육 세포의 수준에서 근육 기능을 평가함으로써 강력한 수단을 제공한다. 이 문서에서 우리는 준비하는 유효하고 신뢰할 수있는 기술 개요 및 테스트는 시험 관내에서 골격 근육 섬유를 투과성이.
Abstract
Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.
Introduction
골격근의 주요 기능은 힘을 발생하는 것이다. 근력은 운동 신경 활동 전위, 신경근 전달, 근육 섬유 활동 전위, 세포 내 칼슘의 방출, 및 규정 및 수축성 단백질의 시스템의 활성화를 포함 이벤트 복잡한 시퀀스를 통해 생체 내에서 유도된다. 구동력 발생이 시퀀스의 최종 결과이기 때문에, 힘의 결핍은 개별 단계 중 하나 이상의 오류로 인해 발생할 수있다. 투과성이 섬유 제조의 중요한 속성은 근원 섬유 장치는 나머지와 관련된 유일한 규제 및 수축 기능을, 생체 내에서 구동력 발생에 필요한 단계의 대부분을 제거한다는 것이다. 조사는 칼슘과 에너지 (ATP)를 활성화의 전달에 대한 제어를 가정하고 그 나라의 공동의 고립 된 규제 및 수축 구조의 평가를 할 수있는 단순화 된 시스템과 보상nfiguration. 생체 내에서 관찰 근육 기능의 변화를 평가할 때 투과성이 골격근 섬유를 사용하여 힘 측정 따라서 가치가있다. 예를 들어, 우리는 미오 스타틴 결핍 마우스 (1)로부터 섬유의 힘 발생 능력을 특성화하는 만성 회전근 2,3- 다음 나타내 영구 근육 약화의 원인을 평가하기 위해이 기술을 사용했다.
현대 광 투과성이 방법론은 초기 연구 영향력 4,5- 추적 연구 그룹 번호로 현재 사용된다. 기술은 문헌에 기재되어있다하더라도, 그들은 아직 비디오 포맷으로 제시되어 있지 않다. 이 문서의 목적은 화학적으로 투과성이 골격근 샘플들로부터 단일 섬유의 최대 힘 발생 능력을 측정하기 위해 업데이트, 유효하고 신뢰성있는 방법을 설명하는 것이다. 이, 본 명세서에서 개별 섬유 세그먼트 (달성하기 ̶0; 섬유 ")은 섬유의 사전 – 투과성이 번들로부터 추출하고 편안한 함유 용액 실험 챔버 내에 배치되어, 정의 기능 그중 10 <㎚이다 칼슘 농도이다. 섬유이어서 강제 변환기에 일단과 길이 컨트롤러 타단에 부착되어있다. 최적 근절 길이로 유지 섬유, 그것은 최대 활성화하여 최대 메트릭 수축력을 유도하기에 충분한 칼슘 농도를 갖는 활성 용액에 전송된다. 포스 데이터 획득 및 저장 퍼스널 컴퓨터를 사용하여 분석한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
투과성이 하나의 골격근 섬유의 수축 특성의 평가는 광범위한 맥락에서 근육 기능을 조사하기 위해 사용된다. 예를 들면 노화 (12)의 효과를 평가 한 연구, 10,13,14 운동, 우주 비행 15, 부상 2,3,16, 약물 치료 17, 18, 질병 (19)과 섬유의 구조와 기능에 유전자 조작 (20, 21)를 포함한다. 때문에 직접 자신의 고유 구성에 근원 섬유의 수축 성능을 평가하는 능력,이 기술은 존재하는 잠재적 교란 효과의 근원 섬유 기능의 부재에 대한 이해를 형성하기에서 매력적인 플랫폼을 제공 할 때 신경 근육 신호 전송 및 여기에 의한 칼슘 방출 연구 대상 시스템에 포함되어 있습니다. 또한, 단 섬유의 기능 시험은 이러한 것과 수축성 단백질 식별 결과를 보완하기 위해 사용될 수있다면역 조직 화학 또는 겔 전기 + 웨스턴 블롯 (22)를 통해 얻을.
골격근의 주요 기능 중 하나는 힘을 발생하는 것이다. 따라서 SF 오, 수축 시스템의 본질적인 힘 생성 능력의 측정, 근육 생리학에 중대한 관심사이다. SF 오의 신뢰성 평가는 섬유 CSA와 F 오 양의 정확한 측정이 필요합니다. 섬유이기 때문에 CSA를 추정 할 때, 일반적으로, 그 길이를 따라 단면적도 단면 원형 없으며, 유니폼, 큰주의를 기울여야합니다. 이를 위하여, 측정은 90 °로 분리 된 두 가지 관점에서, 각 위치에서, 섬유의 길이를 따라 여러 위치에서 실시하고있다. F 오 신뢰성 대책 칼슘 농도 t와 활성 용액을 이용하는, 두껍고 얇은 필라멘트의 오버랩을 최대화하기 근절 길이를 조정하는, 수동적 인 힘 차지 등 여러 세부 사항에주의를 필요최대 활성화 모자 결과, 원하는 실험 온도를 유지하고, 실험 하루 전에 섬유의 최적 보관 조건 (온도 및 시간)을 유지.
여기에 설명 된 단계는 최대 메트릭 힘을 평가하기위한 절차를 설명하는 반면, 골격근 섬유의 다른 중요한 기능적인 특성을 평가하기 위해 종종 바람직하다. 이것은 섬유의 기계적 조작을 추가로 포함하는 실험 프로토콜을 확장함으로써 달성 될 수있다. 예를 들어, 섬유는 상이한 부하에 대해 일련의 단축되는 속도의 측정 력 파워와 속도 파워 10,23,24 관계를 산출 할 수있는 힘의 속도 관계의 판정을 허용한다. 또한, 언로드 된 쇼트닝의 속도는 슬랙 유도 단축 단계 및 measuri 일련인가 이루어져 "슬랙 테스트"(25)을 이용하여 결정될 수있다섬유에 의해 요구되는 시간은 ng를 슬랙을 제거한다. 자주보고 또 다른 운동 매개 변수는 K TR, 일시적으로 모두 분리 기계 섭동 다음 힘 재개발에 대한 속도 상수 (26) crossbridges입니다. 마지막으로, 칼슘 농도 및 활성 구동력 발생 ( "힘 PCA 관계") 사이의 관계는 관심 18 종종이고 임계치 아래에서 수축을 활성화하기위한 레인 징 칼슘 농도 용액의 일련의 광 노출에 의해 결정될 수있다 그 충분한에 시스템은 최대 활성화 따라서 최대 힘 (F O를) 유도합니다.
언급 된 장비의 대부분이 단일 섬유 수축력을 평가하기위한 필요하지만, 다른 장비가 절대적으로 필요하지 않습니다. 길이 제어부는, 예를 들어, 섬유의 신속한 또는 정확한 연장 또는 단축이 필요한 실험 프로토콜에 필수적인하지만 (힘 레코드의 제로 힘 수준이 여전히 몇 가지 방법으로 확인해야하지만) 최대 아이소 메트릭 힘을 평가하는 절대적으로 필요하지 않습니다. 실험 챔버 내에 섬유를 배치 할 때, 단면 영역을 평가하는 동안 유용한 측으로부터 섬유의 관찰을 허용 프리즘은, 반드시 필요하지 않다. 또한, 다른 대안은 챔버 또는 급속 충전을 가능하게 단일 챔버의 수동식 시스템 고안 및 솔루션 비우는 포함한 사용될 수있는 다양한 실험 용액에 섬유를 노출하기위한 수단을 포함한다. 예컨대 15 ° C로서 서브 생리 실험 온도는 일반적으로 기계적 1,2,3,5,8,12,17,27 측정의 재현성을 향상시키기 위해 사용하는 동안 마지막으로, 다른 온도 23 유효 데이터를 생성 할 수있다 솔루션의 특성에 대한 온도 (칼슘 농도, 산도 등)의 영향으로 28 한 고려된다. </P>
시험 용액의 조성물은 여기에 기재된 광 투과성이 기술의 가장 중요한 측면들이다. 용액 조성물에 관한 고려가 복잡하고이 문서의 범위를 벗어납니다. 프로토콜 섹션의 5 단계에서 설명하는 솔루션은 일정한 이온 강도, 양이온 성분 및 삼투압 6,29을 유지하면서 솔루션을 활성화로 미리 활성화로부터 전송시 투과성이 섬유의 빠른 활성화에 중점을두고 설계되었습니다. 용액 조성물에 다른 방법은 다른 연구 그룹에서 주목할만한 성공을 사용하고 일반적으로 공개 바인딩 상수 및 계산 도구 27,30,31 활용되어왔다. 다양한 활성화 용액에 칼슘 이온의 농도는 힘 – PCA 평가로서 준 최대 활성화와 관련된 연구에 중요하다. 이러한 것과 같은 섬유가 완전히 활성화되는 실험 들어 설명D 여기서, 활성 용액 중의 칼슘 농도는 통상적으로 그것의 정확한 지식은 덜 중요하게, 최대 힘을 달성하기 위해 필요한 마진에 의해 편안하게 초과한다. 크레아틴 인산의 첨가는 달리 수축 활성과 연관 될 것이다 intramyofibrillar ATP와 ADP의 변동을 버퍼링 중요하다. 크레아틴 키나제가 ADP에 크레아틴 인산으로부터 포스페이트 전달을 촉진 할 필요가있다. 고온에서 작동 또는 빨리 섬유 (32)에 고속 단축 측정 포함한 높은 ATP 회전율, 결과 실험 조건 하에서, 크레아틴 키나제는 섬유에 결합 된 유지 내인성 크레아틴 키나아제를 보충 용액에 첨가되어야한다. 덜 까다로운 실험 조건 들어, ATP 재생 시스템 (27)은 덜 중요하다.
투과성이 단일 섬유 기술의 한계는 다음과 같습니다. 이러한 테스트에 의해 생성 된 데이터를 정의실험 장치에 부착 된 특정 근원 섬유 단위의 수축 특성. 따라서,이 세그먼트는 차례로, 근육 내의 섬유의 총 수의 작은 부분을 나타내는, 수득되는 다핵 섬유 전체의 단지 작은 부분을 캡처한다. 수사관들은 이렇게 조심스럽게 실험에서 도출 결론을 지원하는 데 필요한 샘플링을 고려해야한다. 또한, 섬유의 기능에 대한 운동 교육 개입의 영향을 평가하는 것은 평가 섬유가 실제로 훈련 기간 동안 모집 있다고 가정합니다. 프로토콜은 섬유의 천연 세포 내 환경을 모방하려고하지만, sarcolemma의 투과성으로 공정은 비특이적이고, 반드시 수용성 세포 성분 자유롭게 입욕 용액 내로 확산 할 수있다. 막 투과성의 또 다른 결과는 섬유 볼륨 (33)의 팽창에 의해 입증 삼투압 균형의 변화이다.섬유 팽윤 myofilament 시스템 34,35 감소 된 칼슘 민감성 결과 액틴과 미오신 필라멘트 사이의 거리를 증가 시키지만, 큰, 삼투 적으로 활성 인 화합물 (34)의 도입에 의해 역전 될 수있다. 고려하는 최종 제한 실험 장치에 섬유를 부착하는 데 사용되는 기술의 결과이다. 이것은 불변 기능적 결손 참석과, 부착 지점에서와 근처 필라멘트 시스템 내의 공간적 관계 왜곡 요구한다. 구체적으로는, 상기 광섬유와 연결 지점에 인접하는 영역의 기능적 손상되고 이에 의해 측정 시스템에 인공적 시리즈 탄성 기여한다.
요약하면, 우리는 시험관 내에서 화학적으로 투과성이 골격근 섬유의 힘 발생 능력을 평가하는 방법을 설명 하였다. 이 기사의 초점은 최대 아이소 메트릭 힘 generatin의 평가되었지만인간 골격근 섬유의 g 용량은, 실험 방법은 변성 및 종, 또는 다른 포유 동물의 범위에 걸쳐 운동 파라미터와의 관계를 결정하는 데 다양한 확장 될 수있다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.
Materials
| Polystyrene culture test tube with cap | Fisher Scientific | 14-956-3D | |
| 0.5 mL screw cap micocentrifuge | Fisher Scientific | 02-681-334 | |
| 0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring | Fisher Scientific | 02-681-358 | |
| Microcentrifuge cryobox | Fisher Scientific | 5055-5005 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | FE20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Nonsterile-suture 10-0 monofilament | Ashaway Line Twine | S30002 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microdissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | |
| Micrometer drives | Parker Hannifin | 3936M | |
| Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
| Temperature controller | Aplha Omega Instruments | Series 800 | |
| LabVIEW software | National Instruments | – | |
| Computer | Varied | – | |
| Chamber system | Aurora Scientific | 802D | |
| Length-controller | Aurora Scientific | 312C | |
| Force-transducer | Aurora Scientific | 403A | |
| Reagents | |||
| K-proprionate | TCI America | P0510 | |
| Imadizole | Sigma-Aldrich | I0125 | |
| MgCl2•6H20 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Brij 58 | Sigma-Aldrich | P5884 | |
| EGTA (acid) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Na2H2ATP•0.56H2O | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| HEPES (acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| MgO | Sigma-Aldrich | 529699 | |
| HDTA (acid) | TCI America | D2019 | |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| KOH (1N) | Sigma-Aldrich | 35113 | |
| HCL (1N) | Sigma-Aldrich | 318949 | |
| Na2CrP•4H2O | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| pH 10 standard | Fisher Scientific | SB115 | |
| pH 7 standard | Fisher Scientific | SB107 |
References
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