Vereinfachte Menschen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolierung und Handhabung
Summary
Im folgenden Protokoll beschreiben wir eine sehr einfache Möglichkeit, Neutrophil Extracellular Traps (NETs) aus humanem Vollblut unter Verwendung leicht verfügbarer Reagenzien zu isolieren. Dann zeigt, wie die isolierten Netze können de einem in vitro-Adhäsionstest mit Krebszellen verwendet werden.
Abstract
Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind vor kurzem im Rahmen der antimikrobiellen Rüstzeug der Neutrophilen zu hinterlassen. Neben ihrer Rolle bei der Bekämpfung von Infektionen haben jüngere Untersuchungen gezeigt, dass sie in vielen anderen Krankheitsprozessen, einschließlich Tumorprogression beteiligt sind. Isolieren von gereinigtem NETs ist ein wesentliches Element, um das Studium dieser Funktionen zu ermöglichen.
In diesem Video zeigen wir, ein vereinfachtes Verfahren zur zellfreien NET Isolierung aus humanem Vollblut unter Verwendung leicht verfügbarer Reagenzien. Isolierte NETs kann dann für die Immunfluoreszenzfärbung Blotting oder verschiedenen funktionellen Assays verwendet werden. Dies ermöglicht eine Bewertung ihrer biologischen Eigenschaften in Abwesenheit des potenziellen confounding Wirkungen Neutrophile selbst.
Ein Dichtegradient-Trenntechnik verwendet wird, um Neutrophile von gesunden Spender Vollblut zu isolieren. Isolierte Neutrophile werden dann von Phorbol-12-myr stimuliertistate 13-Acetat (PMA) zu NETosis induzieren. Aktivierten Neutrophilen werden dann verworfen, und eine zellfreie NET Lager erhalten wird.
Dann zeigt, wie isolierte Netze können in einem Adhäsionstest mit menschlichen A549-Lungenkrebszellen verwendet werden. Die NET-Aktie zur Beschichtung die Vertiefungen einer 96-Well-Zellkulturplatte O / N, und nach Gewährleistung eines angemessenen NET Monoschichtbildung auf dem Boden der Vertiefungen, beschriftet CFSE A549-Zellen zugegeben. Adhärente Zellen werden quantifiziert unter Verwendung eines Nikon TE300 Fluoreszenzmikroskop. In einigen Brunnen, wird 1000U DNAse1 10 Minuten vor dem Zählen zu NETs abbauen hinzugefügt
Introduction
Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind neu entdeckte Neutrophilen stammenden Elemente der Stränge der extrazelluläre DNA von Hunderten von Proteinen und Histone dekoriert zusammen. Sie werden von Neutrophilen im Rahmen von Infektionen und Entzündungen folgende spezifische Reize sezerniert und Erstverbuchung galt, einen Teil der neutrophilen Abwehrmechanismen gegen Infektionen. Sie wurden erstmals gezeigt, dass das Einfangen von verschiedenen mikrobiellen Eindringlinge wie Bakterien, Viren und Pilze 1-3 fördern. Überfüllung der Mikrobe würde dann führen zu seiner Zerstörung sowohl direkt durch NET-assoziierten Proteinen 3,4 und indirekt über lokale Rekrutierung von Phagozyten 5,6. Die Rolle der NETs jedoch scheint nicht beschränkt auf die Verteidigung zu hosten. In jüngerer Zeit haben sie gezeigt, eine wichtige Rolle bei Autoimmunerkrankungen spielen 7,8, Thrombose 9, schwangerschaftsbedingten Störungen 10 und sogar Krebsprogression11,12. Dementsprechend scheint es, daß NETs spielen eine wichtige Rolle in einer großen Anzahl von verschiedenen physiologischen Prozessen. Angesichts der Neuartigkeit dieser Forschung, bleibt noch viel zu in Bezug auf die Mechanismen, durch die NETs ihre Wirkungen ausüben aufgeklärt werden. Hier berichten wir über ein vereinfachtes Verfahren für die Isolierung von NETs in der Abwesenheit von Neutrophilen.
Im folgenden Video zeigen wir, eine vereinfachte und einfache Technik, um NETs aus humanem Vollblut zu isolieren. Zellfreie NETs kann dann in einer Reihe von in vitro-Versuche, einschließlich der Färbung imuunofluorescence verwendet werden, Blotting sowie eine Anzahl von Tests, wie Adhäsion, Proliferation und Migration. Andere Protokolle existieren 13, 19, sie sind jedoch in der Regel langwierig, komplex, teuer und oft geringe Ausbeute 13. Diese vereinfachte Protokoll verwendet basischen Reagenzien, und verringert die Anzahl der erforderlichen Schritte, um Neutrophile zu isolieren, damit die Minimierung der Länge des procedure bei gleichzeitiger Maximierung Ausbeute.
Das folgende Verfahren kombiniert verschiedene Techniken zur Isolation neutrophiler zuvor in der Literatur beschrieben, um ein einfaches Protokoll, wodurch eine sehr reine Probe lebender Neutrophilen erhalten. Wie in der Literatur vorgeschlagen wird venöses Blut in EDTA-Röhrchen gesammelt und innerhalb von 10 min verwendet, um die Aktivierung von Neutrophilen 14 zu vermeiden. Wir verwenden Lymphocyte Separation Medien (LSM) Dichtegradientenzentrifugation Granulozyten und Erythrozyten aus heparinisiertem Vollblut, ein Verfahren von der Ficoll-Dichtezentrifugation Technik zunächst Boyum et al 15 beschrieben angepasst isolieren. LSM ist eine Modifikation des Boyum Formulierung, Natriumdiatrizoat substituiert den Natrium Metrizoat und erfolgreich in vielen Studien verwendet worden, um Neutrophile 16-18 zu isolieren.
Folgende Differential Dichtezentrifugation, Monozyten und Lymphozyten werden verworfen; roten Blutzellen werden dann sedimentiertVerwendung einer 6% Dextran-Lösung 14 und die verbleibenden RBCs lysiert, um eine Population von reinem Neutrophile, die mit Trypanblau und Methylenblau-Färbung verifiziert erhalten.
Zahlreiche Mittel wurden zur NETosis sowohl in vitro und in vivo zu induzieren, einschließlich Lipopolysacchariden (LPS) und Phorbolmyristatacetat (PMA) und Interleukine (IL-8) 3,5,6. In dem folgenden Protokoll werden isolierte Neutrophilen mit 500 nM PMA für 4 h, was gezeigt wurde, dass eine ausreichende Konzentration, um konsistente und zuverlässige NET Bildung ohne die Förderung der Apoptose 19,20 ermöglichen stimuliert.
Nach Isolierung, zeigen wir, wie zellfreien NETs diesem Protokoll erhalten wird, kann in einem Adhäsionstest verwendet werden. DNAse1 verwendet zu verdauen und zu zersetzen NETs, wie zuvor beschrieben, und dient als Kontrolle 2,3,11 somit. Weitere Optionen sind die Verwendung von Neutrophilen-Elastase-Inhibitor (NEI), um NET formati hemmenauf, die eine akzeptable Alternative, wenn das Ziel ist, die NET Bildung anstatt hemmen bewirken deren Abbau 11 ist. Obwohl NEi hat eine Reihe von unterschiedlichen Funktionen hat sich bereits gezeigt, dass NET Abscheidung kann durch NEi durch Blockade der Chromatindekondensation, Kern Degranulation von Neutrophilen und Tod 12 gehemmt werden
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Neutrophil Extracellular-Falle Isolierungsprotokoll in diesem Video gezeigt, kombiniert verschiedene Techniken, die in der Literatur für neutrophile Isolation und NET Bildung verwendet. Es vereinfacht eine ziemlich komplexe und variable Prozess und bietet eine sehr zuverlässige und reproduzierbare Weise gereinigt zellfreien NETs mit weniger Schritte als andere Protokolle zu isolieren. Außerdem werden leicht erhältliche Reagenzien Zugabe verwendet, um die Protokolle der Einfachheit und die Kosten deutlich reduzie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
| Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
| BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
| DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
| F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm) | Falcon | 353025 |
References
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