Summary

Análisis Electrorretinograma de la respuesta visual en pez cebra larvas

Published: March 16, 2015
doi:

Summary

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Abstract

El electrorretinograma (ERG) es un método electrofisiológico no invasivo para determinar la función de la retina. A través de la colocación de un electrodo en la superficie de la córnea, la actividad eléctrica generada en respuesta a la luz puede ser medido y utilizado para evaluar la actividad de las células de la retina in vivo. Este manuscrito describe el uso de la ERG para medir la función visual en el pez cebra. El pez cebra se han utilizado mucho como modelo para el desarrollo de vertebrados debido a la facilidad de la supresión de genes por los oligonucleótidos de morfolino y la manipulación farmacológica. En 5-10 dpf, sólo los conos son funcionales en la retina larval. Por lo tanto, el pez cebra, a diferencia de otros animales, es un poderoso sistema modelo para el estudio de la función visual cono in vivo. Este protocolo utiliza anestesia estándar, micromanipulación y protocolos estereomicroscopía que son comunes en los laboratorios que realizan investigación de pez cebra. Los métodos descritos hacen uso de la ecuación de electrofisiología estándarCONEXIONES y una cámara de poca luz para guiar la colocación de la grabación de microelectrodos sobre la córnea larval. Por último, demostrar cómo un comercialmente disponible ERG estimulador / grabador diseñado originalmente para su uso con ratones se puede adaptar fácilmente para su uso con el pez cebra. ERG de larvas de pez cebra ofrece un excelente método de ensayo de la función visual de cono en los animales que han sido modificados por la inyección de oligonucleótido morfolino, así como las técnicas de ingeniería del genoma más recientes, como los dedos de zinc nucleasas (ZFNs), Transcripción Activador-Como Efector Nucleasas (Talens), y agrupados Regularmente Interspaced cortos Palindromic Repeticiones (CRISPR) / Cas9, todos los cuales han aumentado en gran medida la eficiencia y la eficacia de la orientación de genes en el pez cebra. Además, aprovechamos la capacidad de los agentes farmacológicos para penetrar en larvas de pez cebra para evaluar los componentes moleculares que contribuyen a la fotorrespuesta. Este protocolo describe una configuración que puede ser modificado y utilizado por los investigadorescon varios objetivos experimentales.

Introduction

El electrorretinograma (ERG) es un método electrofisiológico no invasiva que se ha utilizado ampliamente en la clínica para determinar la función de la retina en los seres humanos. La actividad eléctrica en respuesta a un estímulo de luz se mide mediante la colocación de electrodos de registro en la superficie externa de la córnea. Las características del paradigma estímulo y la respuesta de la forma de onda definen las neuronas de la retina que contribuyen a la respuesta. Este método ha sido adaptado para su uso con un número de modelos animales, incluyendo ratones y pez cebra. La respuesta típica de vertebrados ERG tiene cuatro componentes principales: la onda a, que es un potencial córnea negativa derivada de la actividad de las células fotorreceptoras; la onda b, un potencial córnea positivo derivado de la EN células bipolares; la onda d, un potencial de córnea positiva interpretarse como la actividad de las células bipolares OFF; y la onda c, que se produce varios segundos después de la onda b y refleja la actividad en las células de Müller y la retinal epitelio pigmentario de 1-4. Referencias adicionales para la comprensión de la historia y los principios de análisis de ERG en humanos y modelos animales son el libro de texto en línea, Webvision, de la Universidad de Utah y textos tales como los Principios y Práctica de Electrofisiología Clínica de la Visión 4, 5.

Danio rerio (pez cebra) ha sido favorecido como un modelo para el desarrollo de vertebrados, debido a su rápida maduración y la transparencia, que permite el análisis morfológico no invasiva de órganos y sistemas, ensayos de comportamiento y de ambos adelante y atrás pantallas genéticos (para una revisión, ver Fadool y Dowling 6). Larvas de pez cebra son altamente susceptibles de manipulación genética y farmacológica, que, cuando junto con su alta fecundidad, los hacen un excelente modelo animal para los análisis biológicos de alto rendimiento. La mayor proporción de conos para varillas en larvas de pez cebra – aproximadamente 1: 1 en comparación con ratones (~ 3% de conos) – hacen particularmente útiles para el estudio de la función de cono 7-9.

En la retina de los vertebrados, los conos se desarrollan antes de varillas 10. Curiosamente, los conos de pez cebra son operativos ya en 4 dpf, permitiendo selectiva análisis electrofisiológico de conos en esa etapa 6, 11,12. En contraste, las respuestas de ERG en barras aparecen entre 11 y 21 dpf 13. Por lo tanto, las larvas de pez cebra a 4-7 servir dpf funcionalmente como una retina todo-cono. Sin embargo, la respuesta fotópica nativo ERG de 4-7 larvas dpf está dominada por la onda b. La aplicación de agentes farmacológicos, tales como L – (+) – 2-amino-4-fosfono-butírico (L-AP4), un agonista para el glutamato metabotrópicos (mGluR6) receptor expresado por la sobre las células bipolares, bloquea eficazmente la generación de la onda b y revela el potencial de masa aislado cono receptor, (la "onda a") 14-17.

Aquí se describe un simple y reliablmétodo para el análisis e ERG usando equipo ERG comercial, diseñado para su uso con ratones que han sido adaptados para su uso con las larvas de pez cebra. Este sistema puede ser utilizado en larvas de pez cebra de diferentes antecedentes genéticos, así como los tratados con agentes farmacológicos, para ayudar a los investigadores en la identificación de las vías de señalización que contribuyen a la sensibilidad visual y adaptación a la luz 16. Los procedimientos experimentales descritos en este protocolo guiarán los investigadores en el uso del análisis de ERG para responder a una variedad de cuestiones biológicas relativas a la visión, y demostrar la construcción de una configuración flexible de ERG.

Protocol

El mantenimiento de los animales y los protocolos experimentales fueron aprobados por los comités de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, y cumplen con todos los requisitos de la Oficina de NIH de Laboratorio Bienestar Animal y la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International. Se emplearon Para obtener larvas para el análisis ERG, publicado protocolos para la cría de peces cebra estándar y mantenimiento 18: NOTA. Las l…

Representative Results

Típicamente, los ERG se registran a partir de larvas de pez cebra a 5 dpf, ya que un número de estudios han publicado grabaciones ERG en esta etapa 9, 16,20. Respuestas de larvas se midieron en condiciones adaptadas a la oscuridad sin iluminación de fondo utilizando un 20 mseg estímulo de la luz LED blanco. Hemos utilizado un sistema ERG disponible comercialmente que consiste en un estimulador Ganzfeld luz y equipo de controlador / grabadora. El estimulador utiliza una modulación de ancho de sistema para…

Discussion

En este protocolo se detalla un procedimiento sencillo para grabaciones ERG de larvas de pez cebra. Este procedimiento permite un ensayo rápido y completo de function.There visual son varios pasos críticos de todo el procedimiento que se debe tener en cuenta. Las larvas de pez cebra debe estar sano antes del experimento para prevenir la muerte durante los tratamientos farmacológicos potenciales y asegurar medios de vida prolongada durante las grabaciones ERG. Además, es importante que las larvas utilizado en los exp…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

Materials

Name of the Material/Equipment Company Catalog Number Comments/ Description (optional)
Faraday cage 80/20 Inc custom Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework
PVA sponge Amazon B000ZOWG1C Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae
150 ml Sterile Filter systems Corning 431154 Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
Espion E2 Diagnosys, LLC contact Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com
Colordome Diagnosys, LLC contact Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com
Micromanipulator Drummond 3-000-024-R Holding and positioning the recording microelectrode
Magnetic ring stand Drummond 3-000-025-MB Holding and positioning of the camera and refrence electrode
Lead extensions Grass Technologies F-LX Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor Grass Technologies DF-215/10 Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins
Window screen frame (metal) and spline Lowes or Home Depot various For attaching copper mesh to Faraday cage framework
Steriflip 50 ml filters Millipore SCGP00525 Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
BNC adaptor Monoprice 4127 Connecting camera to BNC cable
BNC cable Monoprice 626 Connecting camera to video adaptor
Camera lens Navitar 1582232 Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Camera coupler Navitar 1501149 Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Luna BNC to VGA + HDMI Converter Sewell SW-29297-PRO BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor
APB Sigma A1910 mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential
Borosilicate glass Sutter BF-150-86-10 Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) 
P97 Flaming/Brown puller Sutter P97 For pulling glass micropipettes
Sorbothane sheet Thorlabs SB12A Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size
Breadboard Thorlabs B2436F Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen
Passive Isolation Mounts Thorlabs PWA074 Provides vibration isolation to breadboard
Copper mesh TWP 022X022C0150W36T To line Faraday Cage
Pipette pump VWR 53502-233 Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae
Pasteur pipettes VWR 14672-608 Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae
Camera Watec WAT-902B Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Tricaine (MS-222) Western Chemical Tricaine-S Pharmaceutical-grade anesthetic,
Micro-fil WPI MF28G-5 Filling microelectrode holder and microelectrode glass
Microelectrode holder WPI MEH2SW15 Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment
Reference Electrode WPI DRIREF-5SH Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode
Reference Electrode (alternative) WPI EP1 Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead
Low-noise cable for Microelectrode holder WPI 13620 Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard

References

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check_url/fr/52662?article_type=t

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Citer Cet Article
Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52662, doi:10.3791/52662 (2015).

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