JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie du développement

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

Published: January 31, 2015
doi:
10.3791/52654
, ,
1Davis Center for Regenerative Biology and Medicine,MDI Biological Laboratory

Summary

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Abstract

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

Introduction

The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival 1. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system 2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae 5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages 8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential 13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.

We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells 15. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses 16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days 16, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.

The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.

Protocol

Zebra balığı (sedef suşu) kuruldu protokollere göre yetiştirilen ve yükseltilmiştir. Tüm çalışmalar anestezi ve ötenazi 1 mM Tricaine süre ile 0.4 mM Tricaine kullanılarak acıyı azaltmak için yapılmıştır. Uygun komitesi (MDI Biyolojik Laboratuvarı hayvan çekirdek IACUC numarası 13-20) tarafından onaylanan Zebra balığı embriyolar ve larva iyi hayvan uygulamalarına tam uyum içinde ele alınmıştır. Bu çalışma protokolü # 14-09 altında Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, MDIBL Kurumsal Güvence # A-3562-01 tarafından onaylandı. Not: Aşağıdaki adımlarda özetlenmiştir larva zebrafish fin rejenerasyon yakalar görüntüleme prosedürü: Larva Aşamaları için Zebra balığı 1. yükseltilmesi Yumurta toplama ve 0.00004% metilen mavisi ile takviye edilmiş deiyonize su içinde% 0.03 Anında Okyanus tuzunu ihtiva eden bir 100 x 25 mm Petri kabı içine yaklaşık 50 yumurta yerleştirin. Bir 28.5 ° C inkübatör O / N inkübe. <li> ertesi sabah cam pipet ile ölü embriyolar kaldırmak ve deiyonize su (adlandırılır embriyo orta) 0.03% Anında Okyanus tuzu ile bir süzgeç yumurta durulayın. Not: tercih edilebilir gibi Zil sesleri 18, Hanks 18, E2 19, E3 20, ve Danieau 21 gibi orta. sup> çanak taze embriyo orta ekleyin. Pigmentli türleri kullanılarak Eğer PTU melanogenezis ve larva, böylece renk değişimlerini önlemek üzere, isteğe bağlı olarak, 0.2 mM 1-fenil-2-tioüre (PTU) ekleyin. Embriyolar daha 2 gün sonra döllenme veya herhangi bir diğer istenen larva aşamasına kadar inkübatör geliştirmek edelim. Görüntüleme Odası 2. Hazırlık Yöntem 1: PVC veya teflon borudan yapılmış Görüntüleme odalar (Şekil 1) Not: Bu yöntem konka ve Adams (1998) 22 benzerdir. 25 mm dış An ile bir nalburdan içme suyu kalite plastik veya teflon tüp Edinmeda 20 mm iç çap. Her bir tarafında düz bir yüzeye sahip, yaklaşık 10 mm kalınlıkta halka yapma hortumu kesilir. Kenarları düzeltmek için> 200 kum zımpara kullanın. Sıcak su ve% 70 etanol ile halkaları temizleyin ve onlara hava kurumaya bırakın. Bir pipet ucu ile bir halkanın bir yarısına silikon yağı uygulamak ve 75 mm x 25 mm ebadındaki bir cam kapak kayma halkası ekleyiniz. Seçenek olarak ise, silikon yağı yerine bir pipet ucu ile dolu bir 3 ml şırınga kullanın. Not: 3 ml'lik enjektöre silikon gres eklemek ilk 30 ml şırınga silikon gres ekleyin ve 3 ml şırınga doldurmak için kullanmak zor olduğundan. Yöntem 2: Bir görüntüleme haznesi olarak bir Petri hazırlanması. Kapak (Şekil 2A) bağlı bir cam lamel ile 35 ya da 60 mm çapında Petri kapları elde edin. Distel'de ve Koester (2007) 23, Şekil 3'te gösterildiği gibi, alternatif olarak, saat kadar küçük bir açıklık matkapEski bir küçük Petri kabı kapağının içine lamel ve 3 ml şırınga ile dış silikon gres uygulayın. Temiz bir pipet kullanarak, dikkatle dışarıdan (Şekil 2B) bir yuvarlak veya istenen kalınlıkta kare lamel veriyoruz. Agaroz sıkıca görüntüleme işlemi sırasında takılı kalır monte edilmesi için kullanılan sağlamak için, halka içinde bir ince plastik ağ ekleyin. İlk olarak, bir açı ile ince makas kullanarak iç halka çapı boyutu içine, bir nalburdan alınan pencere ekranın yapılmış örgü kesti. Sonra mesh ortasına> larva iki boyutu küçük bir dikdörtgen kesip (Şekil 1, 2). Kapak slip ve oda halkası (Şekil 1A) arasındaki ara için toksik olmayan silikon yağı dört küçük noktalar uygulanır. Cam lamel altına sıkıca örgü takmak için forseps kullanın. 3. Montaj ve Ön-inj Görüntülemeedili- Larva (Bu adım isteğe bağlıdır) Not: fin rejenerasyon sonra amputasyon uçak Zebra balığı larvaları tanınabilir olmadığı gibi bu adım, ampute ve rejenere fin uzunluğu arasındaki karşılaştırmalar için uygundur. Numunenin Hareketsizleştirmesi için embriyo ortamda bir 0.5-1.2% düşük erime agaroz çözeltisi hazırlayın. Bir mikrodalga fırında agaroz ısıtın ve bir ısıtma bloğu içinde 42 ° C'ye kadar ön-ısıtılır, 1.5 ml tüpler içinde bir sıvı agaroz aktarın. Sıcak agaroz bu sıcaklıkta birkaç hafta içinde muhafaza edilebilir 42 ° C, soğumasını bekleyin. Bu hayvanlara zararlı olacak gibi, agaroz üzerinde 42 ° C içine larva pipetleme önlemek için deneyin. 60 mm çapında Petri kabındaki embriyo ortamı içinde 0.4 mM Tricaine (pH 7) 10 ml kullanılarak çeşitli larva anestezisi. Zebra balığı Kitap Tarifler 18 göre Tricaine hazırlayın. 99: 1000 sulandırılmış olarak Seçenek olarak ise, bir 1 10 ml kullanımı60 mm çapında Petri kabındaki%, 2-fenoksietanol. Devam etmeden önce kendi dokunmatik yanıtı değerlendirmek için bir şapkalı Microloader pipet ile larva Poke. Sadece duyarlı olmayan larvaları kullanın. Bir cam Pasteur pipeti kullanılarak 42 ° C agaroz çözeltisi içine bir larva aktarın. Aksi takdirde agaroz çok seyreltilmiş ve katılaşmaya edilmeyecektir, agaroz içine aşırı sıvı transferi yapmayın. Pipet kalan sıvı atılır ve küçük bir petri kabının (35 ya da 60 mm çapında) içine agaroz bir damla larva aktarın. Kuyruk yüzgecinin görüntüleme için yan larva yerleştirin. Agaroz katılaşmaya izin verin. Plastik pipet ile agaroz değerlendirmek; çok sıvı ise ucu agaroz içine batırmak olacaktır. Agaroz katılaşmış sonra, küçük bir girinti, bir pipet ile dokunmadan üzerine görünür olacaktır. Katılaşma sonrasında, Tricaine çözüm ekleyin ve zaman atlamalı görüntüleme için daha sonra kullanılacak stereomikroskopta geçin. <br /> Not: Bu adım ayrıca, embriyonun ortam içinde% 1.5 agaroz ile kaplanmış bir Petri tabağına anestezi uygulanmış larva yerleştirilmesi ile gerçekleştirilebilir. Time-lapse yazılımı ile Stereomikroskopta kullanın. Time-lapse görüntüleme için daha sonra kullanılacak uygun bir objektif ve büyütme seçin. Burada, bir stereomikroskop bir 3.5 x 16 mm çalışma mesafesi objektif lens kullanmak. İstediğiniz gibi, alternatif mikroskoplar ve objektif lensleri kullanmak ama görüntüleme işlemi sırasında olası xy-sürüklenme ve fin büyümesi için hesap için uygun bir büyütme seçin. Mikroskop kamera algılama modunu seçin. Yazılımda, ekranda larva görmek için 'canlı' modunu seçin. Parlaklığı otomatik olarak algılamak için 'Properties' penceresini açın. Elle mikroskop trans-aydınlatma üssünde kontrast ayarı. Görüş alanının dışına larva taşıyın ve arka plan hay en aza indirmek için Gölgeleme Düzeltme özelliğini seçinimkb. Geri görüş alanı içine larva yerleştirin ve fotoğrafını çeker. Görüntü kaydetme. İlk kafasından agarozun kazıyarak larva agaroz çıkarın. Larva hafifçe başlıklı Microloader pipet ucu veya bir böcek iğne ile kalan agaroz uzak kafa çekerek agaroz dışına kaymış olabilir Bu şekilde. Bir cam Pasteur pipet ile taze Tricaine çözüm içine larva transferi. 4. Amputasyon Deneyi Embriyo ortamı kullanılarak bir% 1.5 agaroz çözeltisi hazırlayın ve bir Petri kutusu içine, ince bir tabaka dökün. Agaroz katılaşmaya edelim. Steromikroskopla, katılaşmış agaroz üzerine larva yanlamasına yerleştirin ve hafif basınç (Şekil 3A) ile 23 G şırınga iğnesi ile kuyruk yüzgeci organını. 5. Time-lapse Görüntüleme için larva Montaj 3.5 (Şekil 3B) – adımlarda 3.1 açıklandığı gibi devam edin. <li>, Görüntüleme odası halka (adım 2.1) içine larva içeren 42 ° C'de 0.5-1.2% sıvı agaroz bir damla transfer larva yönlendirmek ve agaroz katılaşmaya edelim. Tricaine çözeltisi ile halka doldurun. Petri kabı odası (2.2 adım) kullanılmaktadır Alternatif olarak, eğer, kapak lamel üzerine monte larva ve Tricaine çözeltisi ile kapağı doldurun. Gerçekleşmesi için uygun yara iyileşmesi veya doku rejenerasyonu sağlamak için, dikkatli bir şapkalı Microloader pipet veya bir böcek pin kullanarak uzak kuyruk yüzgeci çevreleyen agaroz kazıyın. Fin tekrar tekrar (Şekil 3C) zarar vermemeye çalışın. Agaroz çıkarıldı içeren Tricaine çözeltisi süzün ve taze Tricaine çözeltisi ile oda halka doldurun. Kamara halka üstüne silikon gres sürün ve 75 mm x 25 mm cam slayt ekleyin. Onlar aydınlık görüntüleme müdahale ve zamanla larva kurutulması gibi, odasında hava cepleri önlemek için deneyin. Bir Petri kabı olarak kullanıyorsanızBir görüntüleme odası, alt bölmenin üst kenarının silikon yağı uygulamak ve Tricaine çözeltisi ile alt bölmeyi doldurmak. Dikkatle kapağı Tricaine çözüm süzün ve hava cepleri önlemek için hafif bir açıyla alt odasının Tricaine çözeltisi içine larva batırmak için kapağı ters çevirin. odacık silikon gres nedeniyle kapalı olacaktır. 6. Time-lapse Görüntüleme 23,24 (Şekil 4), bir mikroskop inkübasyon odası .Place ve ısı açmak tarif edildiği gibi ısıtılmış bir inkübasyon odası birleştirin. 20 dakika veya sıcaklık stabilize kadar – yaklaşık 10 28 ° C sıcaklık ayarlayın. Isıtmalı kuluçka odasının önünü açmak ve objektif doğru yukarı bakacak şekilde lamel ile mikroskop standın üzerine görüntüleme odasına yerleştirin. Görüş alanının 2/3 boş kalır bir şekilde larva fin yerleştirin. Bu yakalama sağlarlarva yeniden konumlandırmak için kalmadan büyüme ve görüntüleme prosedürü boyunca fin yenilenmesi. Önceki aydınlık yoğunluğu veya agaroz potansiyel vardiya değişiklikleri önlemek için time-lapse kayıt başlamadan 30 dakika ~ 28 ° C monte larva ayarlayın. Alternatif olarak, kısa ayar süre sonra görüntüleme başlatmak için önceden ısıtılmış tampon kullanmak. Time-lapse kayıt kurmak için, Axiovision yazılımı 6D boyutlu Toplama penceresini açın ve z-yığın ve zaman atlamalı seçeneğini seçin. Z-yığın sekmesi ve Dilim Modunda) İsteğe bağlı, dilim kalınlığı seçin ve ardından Başlat / Durdur modunu seçin. Yığınının üst ve alt pozisyonlar tanımlar. Time-lapse sekmesinde, aralık ve film süresini seçin ve ardından start düğmesine basarak filmi başlatın. Biz 30 dakika aralıkları yeterli ve bu aralık aşırı veri oluşturmak olmadığını bulundu; Ancak shorteR aralıkları kullanılabilir. Larva ön-ayarlı değil ise ilk bir saat içinde pozisyon ve z-yığın boyutlarını kontrol edin. Gerekirse larva kaymış olabilir gibi, bir gün sonra tekrar larva yeniden konumlandırmak. Time-lapse kayıt sonunda dosyayı kaydedin ve post-processing ve Imaris 25 ya da açık kaynak kodlu yazılım paketleri Görüntü J 26 ve Fiji 27 gibi, mevcut görüntü analiz yazılımı kullanarak sayımsal devam edin. 7. Veri analizi Fin uzunluğu belirlenmesi. Görüntüleme yazılımı time-lapse film açın ve yazılım performansını artırmak için özel dosya formatında dosyaları kaydetmek. Öngörülen yığınlar gibi bireysel bölümleri görüntülemek için dik bir görünüm seçin. Sürüklenme düzeltme için, Fiji menüsü altında, Eklentiler, ardından Kayıt ve 'Doğru 3D kayması' seçeneğini seçin. Bu Fiji penceresini açın ve sürüklenme düzeltmeleri yapacak. DoğruImaris Spotlar işlevi dönme sürüklenme. Alternatif olarak, Görüntü J StackReg ve TurboReg eklentileri yüklemek ve Fiji ithal. StackReg eklentisi istenen dönüşüm algoritması seçin. Mesafeleri (örneğin, yara çap veya fin uzunluk) ölçmek için, sol üst araç çubuğunda 'Ekle Yeni Ölçüm Puanları' seçeneğini seçin. Sol alt menüde 'görünür İstatistik Değerler Yapılandırma listesinden' altında, istatistik değerleri görüntülenecek seçin. Ayarlar sekmesi altında 'Hat Modu' In Çiftleri (AB, CD …) 'seçiniz. Seçin 'Name' ve 'Distance' 'Özellikler Etiketler', ölçüm hattına yanında A ve B noktaları arasındaki mesafeyi görüntülemek için. 'Düzenleme' moduna geçin ve Notokordun sonunda ilk noktasını seçmek için shift tuşuna basılı tutun. Sonra uzak fin marjı ikinci noktasını seçmek için aynı yapılandırmayı kullanın. 'İstatistikler' sekmesi altında, görüntülemek ve görüntüde mesafeyi ihracat sağ alt tarafındaki disk düğmesine (İhracat Tümü) seçin. Sağdaki resimde aşağıdaki kaydırma çubuğunu hareket ettirerek seçilen zamanlarda ölçümler tekrarlayın. Bunun yerine yeni Ölçüm Noktaları yaratma, önceki olanları öncelikle sol fare tuşu ile noktayı seçerek, daha sonra aynı anda yeni konumda shift ve farenin sol tuşuna basarak yeniden konumlandırılmış olabilir. Alternatif Ölçme Puan seçeneği, mesafeleri ölçmek için dilim görüntüleyici kullanmaktadır. Dilim görünüm modunda, istenilen konuma ilerleyin ve sol fare tuşu ile birinci ve ikinci pozisyona tıklayınız. mesafe görüntülenir. Bu seçenek, ancak veri ihracat için izin vermez. ImageJ fin uzunluk ve alan belirleme. .zvi Dosya biçimini tanıyan bir eklenti kullanarak ImageJ time-lapse film açın. Alternatif olarak, bir Qu yüklemekickTime dosyası veya tiff dizisi. Not: sıkıştırılmamış tiff dosya biçimini kullanarak, görüntü boyutları belirtilmesi gerekmez. Dosya bilgileri olmadan farklı bir dosya biçimi açılması durumunda, ilk görüntü mesafe ve birim tanımlamak için 'Analiz' menüsü altında 'Set Ölçeği' seçeneğini seçin. 'Piksel Mesafe' 'Set Ölçek menüsünden', tip, piksel değeri 'Bilinen mesafe' tip altında (bu görüntüye eklenen bir ölçek çubuğu piksel sayısını ölçerek elde edilebilir sonra) sonuç elde etmek ölçün tıklayın ve 'uzunluğu Birimi' (genellikle 'um'). Tamam'ı tıklatın. Fin alan ölçümleri araç çubuğunda 'Freehand Seçim' aracını seçin ve sol fare düğmesini basılı aşağı ise yüzgeç anahat boyunca çizerek fin alan anahat için. Fin uzunluk ölçümleri için, 'Düz' satırı aracını seçmek ve olmaya istenen nokta arasında bir çizgi çizinölçüldü. Fin alanı ve uzunluğu görüntülemek için 'Analiz' altında 'Tedbir' seçeneğini tıklayın. Filmin çoklu zaman noktaları için gerekli sıklıkta bu adımı tekrarlayın. Veri istatistik yazılımı kullanarak grafiksel olarak görüntülenebilir.

Representative Results

sunulan teknik, amputasyon yanıt doku onarımı dinamiklerini açıklamak için uygundur. Film yüzgecinin amputasyonu başlangıçta mevcut olan aktin-miyozin kablolar üzerinden kasılmalar ile karakterize bir çanta-string etkisi, tetikler olduğunu göstermektedir 28 fin-kat (Şekil 5 A, B). Eş zamanlı, hücreler yara (film bakınız) uzatılır. daralma dolayısıyla muhtemel hücre ölümüne geçmesi mukadder hücreleri çıkarmak için bir araç olabilir. Bizim sonuçlar daha fin rejenerasyon yaklaşık 14 saat sonrası amputasyon kadar başlatmak değil ise (Şekil 5C amputasyon aşağıdaki 36 saat süresi boyunca yüzgeç uzunluğu ve alanı ile ölçülen larva gelişim büyüme, bağımsız rejenerasyon (film) oluşur göstermektedir D). 1.5 gün sonra toplam rejeneratif fin fin büyüme orijinal uzunluğunun (Şekil 5E) yaklaşık% 60 idi. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar o amputasyon tr göstermektedir yüzgeç kasılması, yara ve zamansal olarak gecikmeli rejeneratif yanıtta hücreler ekstrüzyon iggers. Ekstrüde edilmiş hücreler, büyük olasılıkla hücre ölümü tahsis edilmiş olsa da, bu hücrelerin içeriği daha fazla belirtmekte yarar vardır. Şekil 1. Görüntüleme odası halka montaj Gösterilir (A), silikon yağı ile bir lamel ile bağlı olan bir plastik halkasıdır. Bir plastik örgü silikon yağı, dört küçük noktalarla bölmenin içine takılır. (B) monte edilmiş larva ihtiva eden bölme Tricaine çözeltisi ile doldurulur ve bir cam slayt üstüne takılır. (C) 2 gün eski larva (ok) örgü ilgili boyutunu göstermeye yüksek büyütmede gösterilmiştir monte."_blank"> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. Şekil 2. Görüntüleme odası montaj Petri kapları yapılmış. Gösterilen (A) cam lamel bağlı plastik bir kafes ile ticari cam üst cam alt petri olduğunu. Gösterilen (B) kapak ve silikon gres ile dışarıdan bağlı bir lamel içine delinmiş bir delik olan bir öz-inşa Petri kabı odasıdır. örgü ve larva Tricaine çözeltisi ihtiva odasının içine monte edilmiştir. Odasını kapatmak için, silikon gres alt bölmeye ve bağlı üst kapak üst, dış kenarı uygulanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt = "Şekil 3" src = "/ files / ftp_upload / 52.654 / 52654fig3.jpg" /> Amputasyon ve görüntüleme için bir larva montaj 3. Düzeni Şekil. (A) amputasyon için, bir agaroz kaplı Petri kabı üzerine bir anestezi larva yerleştirin ve bir şırınga iğnesi ile kuyruk yüzgeci organını. Montaj için (B), 42 ° C sıvı agaroz ile dolu bir 1.5 ml tüp içine bir transfer pipet ile larva transferi ve görüntüleme odasına larva içeren bir damla pipet, balık yönlendirmek ve embriyo orta ile agaroz katılaşmış kapak. (C) başlıklı Microloader pipet veya benzeri bir alet kullanarak kuyruk yüzgecinin agaroz kazıyın ve taze ortam ile embriyo orta yerine. (D) Görüntü steromikroskopla kuyruk yüzgeci. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <p class="jove_content" fo:keep-together.within sayfa = "always"> 4. Kendinden inşa ısıtmalı kuluçka odasına Şekil. Gösterilen (AC) karton, bubble wrap ve Velcro yapılmış ısıtmalı kuluçka odası olduğunu. (Başlangıçta tavuk yumurta inkübasyon için tasarlanmış) bir kablolu kubbe ısıtıcı alüminyum bant kullanarak odasına bağlı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 5. Fin rejenerasyon dinamiklerini Şekil. Kullanılan kuyruk yüzgeci amputasyon tahlil ve miktar yöntemi (A) Şema fin uzunluğu (kırmızı ok) ve alan (fin kırmızı anahat) belirlemek için. (B) Kuyruk yüzgeci amputasyon başlangıçta fin kasılması, rege takip tetiklernerative doku akıbet. yanal boyutu artış gösterdiği gibi yüzgeç da, gelişimsel büyüme uğrar. Gösterilen (C), 14 hpa ° 'de doğrusal rejeneratif büyüme başlangıç ​​ortaya zamanın bir fonksiyonu olarak kanat uzunluğu vardır. Kanat alanı (D) miktarının belirlenmesi, başlangıçta fin kasılması atfedilebilir boyutu azalma ortaya koymaktadır. ~ 14 saat sonra, bir doğrusal oranda mali boyutu artar. Amputasyon önce yüzgeç uzunluğu ve 36 saat sonra (E) Karşılaştırma ~% 60 büyütme gösterir. Ölçek çubuğu: 100 mikron Kısaltmalar: pre-amp, ön-amputasyon; Saat amputasyon HPA sonrası; regen, rejenerasyon; amp, amputasyon , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Film . 36 saati boyunca fin rejenerasyonsaat. Gösterildiği rejenerasyon sırasında 2.5 günlük larva bir kuyruk yüzgeci olduğunu. Başlangıç ​​30 dakika sonrası amputasyon rejeneratif büyüme 3.5x objektif lens kullanarak stereomikroskopta 30 dakika aralıklarla görüntülü.

Discussion

sunulan yöntem, bir aydınlık stereomicroscope üzerinde in vivo time-lapse görüntüleme ile Zebra balığı larvaları yaşayan nispeten basit bir set-up kullanarak yara iyileşmesini ve doku rejenerasyonu gözlemlemek için izin verir. Bu prosedür sonucu optimize edecek test ettik bazı önemli yönlerini gerektirir: sürekli büyüyen larva zebrafish büyüme engelleri en aza indirmek olacaktır 1) Düşük agaroz konsantrasyonu (~% 0.5), 2) fin etrafında agaroz çıkarılması önemli değil iyileşme sürecini gizlemek için, 3), bir plastik ağ agaroz Yakalama işlem boyunca sabit bir pozisyonda agaroz ve hayvan korur, ve 4) larva yaşaması için gerekli olan uygun bir sıcaklık-kontrollü bir ortam. Biz karton üzerine bantlanmış kabarcık şal kullanan ısıtılmış kuluçka odasını 23,24, ve sırasında en az dalgalanmalarla sıcaklık ve uygun hava sirkülasyonu kontrol etmek için bir kablolu kubbe ısıtıcı adapte olmasıGörüntüleme işlemi. Bu basit ve maliyet-etkin odası, herhangi mikroskop uyacak şekilde hazırlanabilir. Benzer bir ısıtmalı inkübasyon odası da görüntüleme fareler ve civciv gelişimi 24,29 için kullanılmıştır.

Biz önceden ampute larvalar bir ön-amputasyon görüntüsü için monte edilir öneririz, amputasyon için sökülüp, ve zaman atlamalı görüntüleme için remounted. Nihai görüntüleme odasında tek bir adımda bu adımları gerçekleştirmek için mümkün olsa da, bizim deneyim biz doku gözyaşı ve temiz bir kesim neden yok gibi bir cam lamel kuyruk yüzgeci amputating, optimal değildir bulundu. Bir şırınga iğnesi kullanarak agaroz-tabanlı amputasyon yöntemi başlangıçta Kawakami ve arkadaşları (2004) 16 tarafından açıklanan ve bizim deneyim, aynı zamanda amputasyonlarını gerçekleştirmek için ideal oldu. Böylece, biz sunulan adımları oldukça karmaşık dizi de haklı ve optimal rejenerasyon sonucu sağlar.

Biz larv gösterdi2 dpf'e al Zebra balığı agaroz ve Tricaine çözeltisi 1,5 gün öncesine kadar görüntülü olabilir. Bu sunulan görüntüleme dönem örneğinin sağlığı ile karışmaz Anında Okyanus tuzu ile hazırlanmış, pH-optimum Tricaine (pH 7) çözeltisi kullanılır. Daha önce, ancak, aynı zamanda Danieau ortamında Tricaine ile en az 2 gün 30 konfokal mikroskop larva zebrabalıkları dpf 2.5 zaman atlamalı görüntüleme izin verdiğini gösterdi. Böylece, en uygun tampon koşulları larva sağlık ve görüntüleme süresini uzatabilirsiniz. Seçenek olarak ise, daha düşük Tricaine konsantrasyonları biz de, en az 60 saat süre ile 28 ° C 'de, larva ve yetişkin aşamalarında tolere bulunan anestezi ya da 2-fenoksietanol, için kullanılabilmektedir.

Fin rejenerasyon kusurları önlemek için, biz görüntüleme öncesinde kuyruk yüzgecinin agaroz kaldırıldı. Veri 1.5 gün içinde kanat yaklaşık% 60 yeniden olduğunu gösterir. Bu rejenerasyon oranı 3 gün a tanımlayan bir önceki çalışma ile uyumludur16 dpf 6 Zebra balığı larvaları kadar kuyruk yüzgeci rejenerasyonu için ortalama zamanı. Agaroza alternatif yöntemler ancak görüntüleme için balık monte kullanılabilir. Örneğin, ince bir plazma ışık mikroskobu tabaka 32 için tavsiye edilmiştir 31 ya da fluorinatlı etilen propilen (FEP) tüpler metilselüloz ile kaplanmış ve çok düşük konsantrasyonlarda agaroz (% 0.1) ile dolu pıhtılarını ve sunulan yöntem için de uygun olabilir. Bu numune nedeniyle, bu ortam katılaşması eksikliği odasının altına monte edilir gerektirir ancak biz, metilselüloz ve% 0.1 agaroz önerilmez. Metilselüloz Çok yüksek konsantrasyonlarda üstelik bizim deneyime dayalı hava cepleri oluşturur, ve bu görüntüleme prosedürü engel olabilir. Bu ortam alt bölme kullanarak tercih edilir, bu objektif lens ve numune arasında uygun bir çalışma mesafesi mevcut olması önemlidir. Bu, m unutulmamalıdıro larva sağlık 32 engel olabilecek bir montaj ortamı olarak etilselüloz, sadece 1 gün öncesine kadar tavsiye edilir.

Kapaktaki örneği Montaj yavaş yerçekimi aşağı sürüklenme neden olabilir. Bu nedenle, ya bir tek bir düzlem ya da son film monte edilmesi için ekstre edilebilir odak düzleminde yalnızca görüntü içine yansıtılabilir her bir zaman noktasında en görüntü birden çok bölüm önerilir. Alt odasına numune Görüntüleme potansiyel düşüş sürüklenme önlemek için alternatif bir yöntem olabilir. Plazma örneği stabilize olabilir, bu nedenle dış saran tabakası (EVL, periderm) 31 sopa ve gibi plazma pıhtıları, sürüklenme önlemek için yararlı olabilir. Ancak bu aynı zamanda uzun larva Zebra balığı larva sağlığı veya fin rejenerasyon ile müdahale olmadan plazma pıhtıları muhafaza edilebilir olarak nasıl, test edilmesi gerekmektedir.

Bizim film bireysel bölümleri kullanılarak toplandı (26 mikron)Görüntüleme işlemi sırasında fin potansiyel z-sürüklenme oluşturuyor fin (~ 10 mikron) ve tam kalınlığı kaplı kaydedilmiş z-yığını, bir. 3-D bilgileri korumak amacıyla, bu tek görüntülere z-yığınları proje de mümkündür. Bu görüntünün bulanıklık neden olabilir, çünkü aydınlık dekonvolüsyon arzu edilebilir. Örneğin Deconvolve veya AutoQUANT X3 Yazılım, bu amaç için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, (Tadrous 33 tarif edilmiştir) matematiksel algoritma yüksek sinyal-gürültü oranı (SNR), bir nokta-yayılmış işlevini elde etmek için uygulanabilir. Yüksek SNR Edinme aydınlık deconvolution önemli engellerden biridir. Bu yöntem, yüksek kontrast ve ince numune kalınlığının gerektirmekle birlikte, bunun nedeni indirgenmiş genişliğe kuyruk yüzgecinin görüntüleme için uygun olacaktır.

Sunulan görüntüleme yönteminin açık bir avantajı CCD kamera ile donatılmış herhangi bir stereo hızla adapte olmasıdırd time-lapse yazılım ve düşük maliyetli bir alternatif daha pahalı konfokal görüntüleme sistemleri sunmaktadır. Bu yöntem hücre tespiti için floresan kullanmaz iken, deklanşör kontrolü ve sonrası görüntüleme Dekonvolüsyonun yazılımı 34 otomatik bir sistem kullanılarak bu tür uygulamalar için uzatılabilir. Bu daha uzun süreler boyunca tek bir hücre ya da hücre içi çözünürlük ile yara onarımı ve yenilenmesi süreçlerini gözlemlemek için kullanıcıların sağlayacak.

Optik netlik ve kolaylığı embriyonik ve larva Zebra balığı ile ele alınabilir ve herhangi bir stereo bu yöntemin uyum, bir sınıf ortamında temel omurgalı biyoloji öğretimi için uygun hale getirir. Bu yöntem doku onarımı ve yenilenmesi altında yatan temel biyolojik süreçlerin daha iyi anlaşılması öğrencilere sağlayabilir. Benzer bir yöntemle yakalanan diğer biyolojik süreçler Zebra balığı embriyonik gelişim 23,34 ve kalp vardırfonksiyonu (yayımlanmamış). Bu yöntem aynı zamanda genetik ve farmakolojik manipüle edilmiş larva izleme yara onarım ve yenilenme imkanı sunuyor.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the MDI Biological Laboratory animal core service facility for zebrafish maintenance. Research reported in this publication was supported by Institutional Development Awards (IDeA) from the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under grant numbers P20GM104318 (for COBRE) and P20GM103423 (INBRE) and Department of Defense – USAMRAA (W81XWH-BAA-1) grant.

Materials

Reagents
Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500)
Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100)
1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690] 
Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store)
Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140)
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505) 
2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699)
Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008)
Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007)
Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013)
5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher)
35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm
Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15)
Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75)
Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15)
Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal – 48" (Home Depot)
DOW CORNING® HIGH VACUUM GREASE
Microloader pipette tips 20 µl (Eppendorf, Cat. No. 930001007)
Fine Scissors – Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10)
3 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309657)
60 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309653)
23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145)
Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00)
Equipment
LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci)
Zeiss Discovery.V12 compound microscope 
Zeiss Plan Apo S 3.5X objective
Zeiss AxioCam MRm 
Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011) 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. San Miguel-Ruiz, J. E., García-Arrarás, J. E. Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumber Holothuria glaberrima. BMC Dev Biol. 7, 115 (2007).
  2. Poss, K. D., Keating, M. T., Nechiporuk, A. Tales of regeneration in zebrafish. Dev Dyn. 226, 202-210 (2003).
  3. Akimenko, M. A., Marí-Beffa, M., Becerra, J., Old Géraudie, J. Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration. Dev Dyn. 226, 190-201 (2003).
  4. Slack, J. M. Regeneration research today. Dev Dyn. 226, 162-166 (2003).
  5. Seifert, A. W., et al. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561-565 (2012).
  6. Goss, R. J., Grimes, L. N. Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes. J Morphol. 146, 533-542 (1975).
  7. Williams-Boyce, P. K., Daniel, J. C. Comparison of ear tissue regeneration in mammals. J Anat. 149, 55-63 (1986).
  8. Allan, C. H., et al. Tissue response and Msx1 expression after human fetal digit tip amputation in vitro. Wound Repair Regen. 14, 398-404 (2006).
  9. Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
  10. Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Dev Biol. 315, 125-135 (2008).
  11. Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Res C Embryo Today. 84, 265-280 (2008).
  12. Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
  13. Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M. Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish. Development. 121, 347-357 (1995).
  14. Reginelli, A. D., Wang, Y. Q., Sassoon, D., Muneoka, K. Digit tip regeneration correlates with regions of Msx1 (Hox 7) expression in fetal and newborn mice. Development. 121, 1065-1076 (1995).
  15. Brien, G. S., et al. Coordinate development of skin cells and cutaneous sensory axons in zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 520, 816-831 (2012).
  16. Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev Dyn. 231, 693-699 (2004).
  17. Yoshinari, N., Ishida, T., Kudo, A., Kawakami, A. Gene expression and functional analysis of zebrafish larval fin fold regeneration. Dev Biol. 325, 71-81 (2009).
  18. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  19. Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, part A. Preface. Methods Cell Biol. 100 (13), (2010).
  20. Dahm, N. -. V. a. . Zebrafish: A Practical Approach, Issue 975. , 303 (2002).
  21. Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. . The Zebrafish: 2nd Edition Genetics, Genomics and Informatics. , (2005).
  22. Concha, M. L., Adams, R. J. Oriented cell divisions and cellular morphogenesis in the zebrafish gastrula and neurula: a time-lapse analysis. Development. 125, 983-994 (1998).
  23. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. CSH Protoc. 2007, (2007).
  24. Kulesa, P. M., Kasemeier-Kulesa, J. C. Construction of a Heated Incubation Chamber around a Microscope Stage for Time-Lapse Imaging. CSH Protoc. 2007, (2007).
  25. . Bitplane. Imaris V 6.1.0 Reference Manual. , (2008).
  26. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. . Image Processing with ImageJ. , 36-42 (2004).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  28. Mateus, R., et al. In vivo cell and tissue dynamics underlying zebrafish fin fold regeneration. PLoS One. 7, e51766 (2012).
  29. Jones, E. A., et al. et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
  30. Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., Köster, R. W. Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons. PLoS Biol. 7, e1000240 (2009).
  31. Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).
  32. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
  33. Tadrous, P. J. A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution. J Microsc. 237, 192-199 (2010).
  34. Distel, M., Babaryka, A., Köster, R. W. Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy. Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).

Tags

ZebrafishLarval Tail FinTime-lapse Brightfield StereomicroscopyWound ContractionCell ExtrusionFin RegenerationDevelopmental Growth

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Lisse, T. S., Brochu, E. A., Rieger, S. Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy. J. Vis. Exp. (95), e52654, doi:10.3791/52654 (2015).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image