High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi
Summary
This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.
Abstract
Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.
Introduction
Tipo I e III interferoni (IFN) sono fondamentali per la risposta immunitaria al virus e altri stimoli patogeni e presente in tutti i vertebrati 1. Le cellule immunitarie e non immune esprimono e secernono, oltre che rispondere a, IFN 2. Sensori immunitarie innate, come i recettori Toll-like (TLR), Sting, e RIG-I, inducono tipo I e di espressione III IFN al rilevamento dei modelli molecolari patogeni associati (PAMP) 3,4. Negli esseri umani, di tipo I IFN includono IFN-β, -ω, -κ, e 12 sottotipi di IFN-α, e si legano al recettore IFNAR1 / IFNAR2 complesso 2,5. Tipo IFN III includono IFN-λ1, -λ2, e -λ3 e legano al complesso recettoriale IL10RB / IL28RA 2. Classicamente, tipo I e III IFN legano ai rispettivi complessi recettoriali che poi reclutano STAT1 / eterodimeri STAT2 e iniziare la trascrizione di interferone stimolato geni (ISG) 6. ISG sono coinvolti in una vasta gamma di funzioni, dalla antivirali e antiattività proliferativa di attivazione della risposta immunitaria adattativa 7.
I numerosi meccanismi patogeni si sono evoluti di eludere, sovvertire, e dirottare elementi della via di segnalazione IFN dimostrano l'importanza di IFN nella risposta immunitaria innata 8. Ad esempio, il virus vaccinia esprime un recettore decoy con IFNAR1 omologia che sequestra tipo I IFN 9, mentre un virus della malattia Yaba-come secerne una glicoproteina che inibisce I e III IFN proteine 10 tipo. Oltre al loro ruolo nella difesa dell'ospite, IFN sono anche implicati nella sorveglianza cancro e un certo numero di malattie auto-infiammatoria: silenziamento dell'espressione IFN in cellule di carcinoma mammario limita immunosorveglianza 11, sovrapproduzione di IFN-α è un meccanismo per lo sviluppo di sistemica lupus eritematoso 12, e l'attivazione errante di STING porta a infiammazione sistemica causata da una quantità eccessiva di IFN a vasculopatia STING-associato13. Terapeutico, IFN sono usati per trattare la sclerosi multipla 14, infezioni virali croniche come HBV e HCV 15 16,17, e tumori come leucemia a cellule capellute 18 e leucemia mieloide cronica 19. Domande sulla rilevanza di IFN in un particolare processo fisiologico rivelano continuamente il carattere ubiquitario di questa famiglia delle citochine.
Tipo I IFN, soprattutto i sottotipi IFN-α, sono spesso considerati come un'unica entità 20-23, piuttosto che come un gruppo di strettamente correlati, ma distinti, le proteine. L'esistenza e la persistenza di molteplici specie IFN inclusi i sottotipi IFN-α, nel corso dell'evoluzione dei vertebrati 24 suggerisce che almeno un sottoinsieme di questi sottotipi hanno funzioni specifiche o esclusive. È possibile che definiscono pattern di espressione IFN saranno decifrare e contribuire caratterizzano le funzioni specifiche di uno o più dei sottotipi 17. La sfida di studiare tegli tipo sottotipi I e III IFN si basa sulla loro identità sequenza condivisa: i dodici sottotipi IFN-α condividono> 50% 25 e sottotipi IFN-λ condividono 81-96% 26 delle loro sequenze di aminoacidi. Nel descritto test qRT-PCR, faro molecolare (MB) e l'acido nucleico bloccato (LNA) sonde fluorescenti discriminano singole differenze coppie di basi tra le sequenze molto simili IFN sottotipo e consentono la caratterizzazione della firma espressione IFN. 384-ben formato piatto del test comprende sia gli standard (trascrizione) e quantitativi (i geni housekeeping (HKG)) semi-quantitative misure, consentendo l'analisi in base al numero di copia e trascrizione ΔCq rispettivamente. Montaggio Batch, facilitato pipettando automatizzati multicanale, e la conservazione a lungo termine, possibile attraverso l'asciugatura del primer / sonda (Pr / Pb) imposta sulle piastre, migliorare la riproducibilità, utilità e la praticità del test.
Questo protocollo descrive il processoper la preparazione di piatti a 384 pozzetti test qRT-PCR (Figura 1) con un massimo di diciassette diversi set Pr / Pb di targeting sottotipi IFN umani (Tabella 1). Pr / Pb set di lavoro piastre stock di origine (Figura 2) vengono utilizzati per la preparazione di più 384 pozzetti piastre saggio in un processo che può essere automatizzato usando una pipetta multicanale robotico. Mentre l'attenzione iniziale era sulla creazione di un protocollo per studiare firme espressione IFN umani, questo metodo è stato applicato a macachi rhesus pure. Sebbene i layout piastra sono leggermente diverse e gli insiemi Pr / Pb (Tabella 2) sono distinti, il metodo di preparazione complessivo per creare le piastre umani e rhesus è identico. Con modifiche minime del protocollo, il metodo può essere eseguito per consentire lo sviluppo di saggi per studiare altri gruppi di geni strettamente correlati.
Vedi figure 1 e 2 qui sotto
Vedi tabelle 1 e 2 Below
Protocol
Representative Results
Discussion
Tale relazione descrive la progettazione, produzione in lotti, e un approccio verso l'analisi di un test per misurare la trascrizione di una serie di geni molto simili in laboratorio di ricerca. Il test high-throughput qRT-PCR qui riportato misura la IFN-e – sottotipi λ con alta specificità. Questo metodo comporta due aspetti fondamentali, la progettazione di insiemi Pr / Pb che discriminano tra i membri di una famiglia di geni omologhi e lo sviluppo di una piattaforma di produzione per la realizzazione di lastre test 384 e affidabili e coerenti precaricati con i set di Pr / Pb. Le sonde qRT-PCR incorporano un (MB) o chimica (LNA) approccio strutturale verso il rafforzamento della loro specificità 29. Per due dei set di primer nel test rhesus (Tabella 2), il sistema di amplificazione mutazione refrattaria (ARMS) è stato incorporato nelle sequenze dei primer per migliorare ulteriormente la specificità 30. Mentre è generalmente meglio indirizzare giunzioni esone-esone a li esalta con gnce la specificità di una reazione qRT-PCR, questo non era possibile, perché il tipo di IFN geni mancano introni. Pertanto, il DNA genomico sarà amplificato nella reazione PCR, e deve essere degradata mediante trattamento DNasi dopo l'estrazione di RNA.
La regione di destinazione per i set di Pr / Pb è stata limitata alle regioni codificanti del peptide maturo per ogni IFN. A causa della alta somiglianza di sequenza tra i sottotipi di IFN-α, in particolare la regione peptide maturo, a volte era necessario compromettere sensibilità per garantire la specificità. Ciò è avvenuto in particolare con IFN-α17, dove il peptide trascrizione matura ha solo quattro basi uniche quando confrontato con gli altri sottotipi IFN-α. Targeting IFN-α17 richiede primer che legano le trascrizioni delle più sottotipi, limitando la specificità alla sonda. Di conseguenza, la reazione PCR amplifica sottotipi diversi IFN-α17, consumando quindi una percentuale sostanziale dei reagenti PCR e lowering l'ampiezza del segnale di fluorescenza della sonda specifica per IFN-α17. Un'ulteriore sfida verso la progettazione di insiemi Pr / Pb sensibili e specifici per i geni molto simili, come l'IFN è la possibilità che le sequenze annotati nel database GenBank potrebbero non essere completa o completa al momento della progettazione. Ancora una volta, questo era una sfida per IFN-α17, in cui le sequenze di recente annotati non si allineano perfettamente con la versione della sequenza del database al momento della progettazione. Pertanto, quando si progetta Pr / Pb imposta per i geni che non sono state intensamente studiate, è consigliabile controllare periodicamente l'ultima sequenza ragionata di un gene bersaglio. Infine, è necessario garantire che gli insiemi Pr / Pb non amplificano pseudogenes che possono essere trascritti ma non tradotte.
Dopo aver disegnato i set Pr / Pb, la prossima sfida è l'ottimizzazione delle condizioni di PCR di diciassette diverse Pr / Pb imposta su una piastra a 384 pozzetti. Norme Transcript sono important a testare la specificità di un insieme Pr / Pb e diventare indispensabile per armonizzare le condizioni qRT-PCR delle numerose reazioni PCR diverse. Test di un set Pr / Pb contro le norme di trascrizione stabilisce la sua efficienza e la sensibilità; plasmidi che esprimono pseudogeni molto simili possono essere necessarie per assicurare che il Pr / Pb set misura selettivamente la trascrizione del gene funzionale. Gli standard trascrizione fornisce anche un mezzo di analisi quantitativi (numero di trascritti), in aggiunta all'analisi semi-quantitativa rispetto ad un gene housekeeping (ΔCq).
Robotic pipettaggio multicanale da una piastra di fonte a 96 pozzetti in più 384 pozzetti piastre test migliora la precisione e la coerenza dei risultati tra le piastre. DNA di sperma di salmone (ssDNA) viene utilizzato come vettore che stabilizza e conserva i set Pr / Pb di stoccaggio a lungo termine, come fa essiccamento dei reagenti erogate nelle piastre. Essiccazione le piastre diminuisce anche il volume della reazionenecessaria per ottenere risultati riproducibili, che a sua volta conserva preziosi campioni e diminuisce l'uso di reagenti costosi. Attraverso questi passaggi, lotti di piastre sono montate che forniscono precisione e coerenza per più di sei mesi.
Dopo la preparazione piatto, le misure di controllo di qualità sono fondamentali per verificare la coerenza di un lotto di piastre. A questo scopo, un ulteriore quattro serie di norme vengono eseguiti su una piastra. La piastra "standard 5x" tiene traccia delle prestazioni e crea un set di dati a cui gli standard di un piatto individuale vengono confrontati. Mentre dieci diluizioni di 10 volte di ciascuno standard vengono utilizzati durante la progettazione dosaggio, considerazioni di spazio richiedono che quattro punti sono usati per la curva standard su ciascuna piastra di dosaggio e per la piastra standard 5x. Inoltre, un controllo positivo dovrebbe essere inclusa su ciascuna piastra per garantire la validità della piastra.
In genere, ci vogliono 3-4 ore per preparare sei piastre test da un Pr / Pb sPiastra ource; è fattibile preparare dodici piastre in un solo giorno in un laboratorio di ricerca. Poiché ogni piastra di dosaggio sottotipo IFN umano esamina diciassette insiemi Pr / Pb e può ospitare quindici campioni sperimentali, un giorno di assemblaggio produce un lotto di piastre con la capacità di generare fino a 3.060 punti dati sperimentali. I dati grezzi dalla piattaforma qRT-PCR possono essere elaborati e assemblati utilizzando script di programmazione in un software foglio di calcolo per compilare automaticamente un modello di analisi predefinito. Questo metodo riduce hands-on di inserimento dati, impedendo in tal modo errori di copiatura e consente al ricercatore di concentrarsi sull'analisi dei dati piuttosto che l'assemblaggio dei dati. Come descritto qui, questa alta produttività assay qRT-PCR può essere applicato per misurare l'espressione di sottotipi di interferone in campioni macaco rhesus e umana o potrebbe essere adattato da utilizzare per altre specie o insiemi di geni omologhi. La flessibilità del layout di piastra permette all'utente di cambiare fondo / probe imposta per adattare i geni diinteresse verso un particolare tipo di cellula o sistema modello. Questo test può essere applicato per misurare IFN firme di espressione in modelli di coltura cellulare che studiano agenti patogeni o nei campioni di pazienti nel contesto di modelli di malattia per chiarire i meccanismi di segnalazione coinvolti nella risposta immunitaria.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency accordo YI-AI-6153-01, FDA / CBER fondi intramurali, e la FDA contromisure mediche Initiative. TCT, MNB, VPM, LMS, e KDK sono stati sostenuti da un appuntamento al Programma Partecipazione di ricerca presso il Centro di Valutazione e Ricerca Biologics amministrato dal Ridge Institute Oak per l'educazione scientifica attraverso un accordo tra gli Stati Uniti Interagency Departmen dell'Energia e degli Stati Uniti Food and Drug Administration.
Materials
| 0.2mL PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
| 12-channel Electronic Pipette, 5-250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
| 2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
| 8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
| Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
| E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
| Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
| Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
| Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
| LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
| LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
| Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
| MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
| Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
| Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
| Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
| Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
| RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
| RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
| Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
| SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
| ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
| Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
| Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
| Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
| Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |
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