Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

La visualizzazione delle cellule e funzioni cellulari di organi interi o persino interi organismi è stato di grande interesse per più di 50 anni, tra cui quasi tutte le parti del corpo ^2. Pertanto, alcuni primi studi già impiegati l'imaging intravitale del fegato ^3,4. Tuttavia, alcune limitazioni esistono aggiornati riguardo a lungo termine ad alta risoluzione stabile di imaging di tessuto epatico.

A causa della posizione anatomica del fegato in stretto contatto con il diaframma e il tratto gastrointestinale ^5, il problema più comune per l'imaging microscopico intravitale è movimento dovuto alla respirazione e, in misura minore, peristaltica del tratto intestinale ^6. In confronto ad altri organi solidi, chirurgia epatica è particolarmente impegnativo. A causa della struttura microvascolare densa, manipolazione chirurgica può portare a massicce lesioni emorragiche, alterata microcircolazione ⁷ e anche l'attivazione di residente icellule mmune come le cellule di Kupffer ^8. Pertanto, fissaggio meccanico del tessuto come pubblicato altrove ^6,9 rischia di interferire con imaging microscopia intravitale.

In un fegato sano, 10-15% del volume totale del sangue risiede all'interno del sistema vascolare del fegato, e l'organo riceve circa il 25% della gittata cardiaca complessiva ^10, rendendo l'organo altamente sensibili alle variazioni di circolazione (ad esempio, variazioni di pressione sanguigna ). Di conseguenza, le interruzioni nel flusso epatico causa ad esempio, shear stress, spostamento, lesioni da uso eccessivo tessuto o circolazione centralizzata porterà ad alterazioni artificiali in leucociti comportamento migratorio, ridotta ossigenazione del fegato e quindi ulteriori danni al fegato, che colpisce fegato risposte immunitarie come pure come conservazione dell'organo e la durata complessiva dell'animale.

I primi studi microscopici erano basati su mi epifluorescenza intravitalemicroscopia, ma molti vincoli tecnici, quali foto sbiancamento e la profondità di penetrazione bassa limitano l'uso di questa tecnica per il lungo termine l'imaging del fegato ^4,11,12. Con lo sviluppo della microscopia multiphoton nel 1990, le limitazioni della foto sbianca o profondità di penetrazione erano principalmente risolti, come questo nuovo metodo era tecnicamente in grado di svolgere studi di imaging in quasi tutti gli organi sotto situazioni reali ^13-15. Tuttavia, le principali sfide rimanenti rispetto all'imaging fegato sono stati: i movimenti del respiro, autofluorescenza di tessuto epatico, che fissano inalterato il flusso di sangue nelle sinusoidi epatici, e di imaging particolarmente stabile per un periodo di diversi hr ¹⁶ più lunghi.

Anche se diversi studi hanno affrontato la funzione e la migrazione dei vari leucociti nel fegato ^17, ad esempio, NKT cellule ^18-20, le cellule T ^21,22, i macrofagi del fegato ^23,24 o neutrofili ^25, a lungo termine multiphoton mImaging icroscopy non era ancora stato stabilito con successo, un compito ancora più impegnativo in animali affetti da malattia epatica acuta o cronica a causa dei danni esistente e quindi maggiore suscettibilità a ulteriori danni ^26. Tuttavia, il monitoraggio comportamento migratorio e la funzione cellulare dei leucociti nel fegato in tempo reale consente nuove intuizioni nel loro ruolo specifico nella omeostasi del fegato e malattie ^27.

Il CXCR6 recettore delle chemochine è espresso in diverse sottopopolazioni linfocitarie, tra cui natural killer (NK), le cellule NKT e alcune popolazioni di cellule T ^18,28. Precedenti studi sui topi hanno indicato che CXCR6 e la sua CXCL16 ligando affine possono controllare il pattugliamento delle cellule NKT su sinusoidi del fegato durante l'omeostasi. Di conseguenza, l'uso di topi CXCR6.gfp (portando un knock-in della proteina fluorescente verde [GFP] nel locus CXCR6) è stata descritta per studiare la migrazione dei linfociti in vari organi come il cervello ²⁹e anche il fegato ^18,20, mostrando aumento infiltrazione di cellule CXCR6.gfp su infiammazione.

Con il metodo fornito in questo studio è stato possibile seguire questi processi per un lungo periodo di tempo in condizioni stabilizzate. La procedura basata multiphoton intravitale permesso di imaging che era altamente riproducibile con il minimo turbamento dell'animale e l'organo; ottimizzata per il lungo termine animali sopravvivenza da un ampio monitoraggio seguito da vicino il controllo della respirazione e della circolazione; e altamente flessibile e facile da adottare anche ad altri organi parenchimatosi come il rene, milza.