免疫低下アダルトゼブラフィッシュへの正常および悪性筋細胞移植

全ての動物手順は、プロトコル＃2011N000127の下で、研究動物管理上のマサチューセッツ総合病院小委員会によって承認された。 アダルトRAG2 E450fsホモ接合変異体ゼブラフィッシュへのセクション1.骨格筋細胞移植アダルトゼブラフィッシュドナー骨格筋細胞の作製蛍光的に筋肉をラベルしているトランスジェニック大人のゼブラフィッシュを入手します。この実験では、30α アクチン-RFPドナー魚25は、レシピエント魚あたり1×10 6個の細胞を移植するために利用された。 10分間または全く蓋の動きが明らかにされなくなるまで/ mlのトリカインメタン（MS222）1.6 mgの犠牲ドナーゼブラフィッシュ。 吸収性ペーパータオル上ドナー魚を置き、きれいなカミソリの刃を使用して、背部の筋肉を切除。カットは、 図1（a）に述べたように、組織のコレクションを（最大化するために45°の角度で肛門付近でなされるべきである</strong>）。きれいな10センチメートルペトリ皿に解剖した組織を置きます。 切開した組織に500μlの懸濁緩衝液（予め冷却0.9Xリン酸緩衝生理食塩水、5％ウシ胎児血清（FBS）を補充した（PBS））を加える。 10ドナーゼブラフィッシュまで、このボリューム内に一緒に配置することができる。 細胞は均一な懸濁液になるまで> 20倍かみそりの刃で組織をミンチ。全体背部の筋肉組織は、皮膚、骨、フィンなどの均質化される。懸濁バッファーの2ミリリットルを追加します。を5mlピペットを用いて、細胞を解離するために、細胞懸濁液を≥20回粉砕する。 氷上に置いた50mlコニカルチューブに40μmのメッシュストレーナーを通して細胞懸濁液を濾過する。 5ミリリットル（10ドナー魚が分離株ごとに使用することができます）の最終容量に、同じストレーナーと円錐管を通じて残りの組織を収集し、フィルタリングするために懸濁緩衝液のさらに2.5 mlのペトリ皿を洗ってください。 注：皮膚、骨やフィンを濾過以下除外されます。 </li> 該当する場合は、同じコニカルチューブに類似した懸濁液を兼ね備えています。 トリパンブルー色素と血球計数器を用いて生存細胞の総数をカウントします。 （オプション、ステップ2）必要に応じて、フローサイトメトリーのために500μlのを予約。 4℃で10分間、1,000×gで遠心細胞懸濁​​液、。 3.33×10 5細胞/μL（0.9X PBS + 5％FBS）で上清を再懸濁細胞を捨てる。合計では、3μlを受信者ごとに1×10 6細胞（ステップ3）の合計のためのレシピエント魚あたりに注入されます。 注：細胞懸濁液の3未満のμlをレシピエント魚に移植しなければなりません。細胞数は、受信者ごとに5×10 4個の細胞だけ低く制限されている場合は移植の成功した（ 表1）につながる可能性がある。 ドナー骨格筋細胞の準備2.フローサイトメトリー分析（オプション） 私を概説したように、野生型 、非トランスジェニック魚から筋肉を分離nは1.1ステップ。このサンプルは、陰性対照として機能し、フローサイトメトリーゲートを設定するのに有用である。 適切な実行可能性染料を追加します。例えば、筋肉の準備の500μlに株式のDAPI溶液（500 ng /μLで）の5μlを添加する。分析に少し前にボルテックス。 5×10 3〜1×10 4のイベントを取得する。トランスジェニック魚から単離された筋細胞の分析に続いてゲートを配置する最初の野生型の対照試料を分析する。 注：フローサイトメトリー分析は、通常、切開し、細胞が60％以上の生存率（ 図2）を保持し 、その間に筋肉組織の切開、後1時間以内に行われる。細胞は常に氷上で維持されるべきである。全細胞の生存率は、トリパンブルー色素および血球計を用いて、移植前に再評価することができる。 アダルトRAG2ホモ接合変異体ゼブラフィッシュへの骨格筋細胞の3筋肉内移植 10μを清掃してください;で描画し、70％エタノール（5回）、続いて10％の漂白剤溶液（5回）、放出、その後懸濁バッファー（0.9X PBS + 5％FBS、10回）、続いによってリットル26S Gマイクロシリンジ。 遅い蓋の動きまで、システムの水に魚を含むペトリ皿にトリカインメタン（MS222、4 mg / mlのストック溶液）の単一滴を加えることにより（コントロールなど）2-4ヶ月のホモ接合RAG2変異体魚や野生型レシピエント魚を麻酔そして魚はまだです。 注：トリカイン麻酔の投与量は、受信者のゼブラフィッシュの年齢とサイズに依存します。 左サイドを上に向けて、湿ったペーパータオルやスポンジに麻酔をかけ、受信者のゼブラフィッシュを置きます。 latero-背部筋肉組織に注射針を挿入します（ 図1Aを参照）。注射は45°の角度で行われていることを確認します。受信者ごとに1×10 6個の細胞の合計魚あたり（ステップ1.12で調製）細胞懸濁液の3μLを注入。慎重に回復するプラスチック製のスプーンを使用してクリーンタンクに注入ゼブラフィッシュを転送する。 明視野および落射蛍光顕微鏡下で麻酔をかけた魚を撮影して、移植後30日間、10、20で生着率の受信者ゼブラフィッシュを評価する。 アダルトホモ接合RAG2変異ゼブラフィッシュへの第2節胎児性横紋筋肉腫（ERMS）移植ゼブラフィッシュ胚の4。DNAマイクロインジェクション 6時間またはO / N、37℃で、XhoIで10μgのDNAを消化し ​​てRAG2-kRASG12Dプラスミド7を直線化。 標準的なフェノールDNAを精製：クロロホルム抽出し、エタノールで沈殿させる。脱イオン水20μl中に再懸濁し（あるいは、市販のDNA断片の精製カラムを使用することができる）。 1％アガロースゲル上で未消化および消化されたDNAを実行し、DNA bの濃度を決定するyの分光計読取。 1％アガロースゲル上で5、および1：10の希釈およびDNAラダーと比較して定量化する：1、1：あるいは、1でサンプルを実行する。 0.1 M KClおよび0.5XトリスEDTAで消化されたRAG2-kRASG12D DNAの15 ng /μLでの最終濃度で注入ミックスを調製する。注入量の2 NLに注入された最終DNA量は30頁になります。 注：最大3つの異なるDNA構築物を効率的に胚あたりのDNAの60、PGの最大共注入することができる。これらの導入遺伝子は、ゲノムに組み込まになり、開発腫瘍26内共発現。 興味のあるゼブラフィッシュ株（ 図1B）に27を説明するように、基本的に1細胞期胚に線形化されたRAG2-kRASG12Dを注入。注射は細胞内ではなく、より高い効率のために卵黄で行ってください。この実験では、二重トランスジェニックAB-株では、Myf5の-GFP、mylpfa-mCherryを使用した。標準の飼育pを用いてゼブラフィッシュを上げるrotocols 28。 注：インジェクションの生存は頻繁に使用されるゼブラフィッシュひずみに依存している。平均して、注入した胚の30％はERMSを開発します。 300〜600胚は十分なGFP陽性とmCherryを陽性原発腫瘍を移植し、分析のために生成されることを保証するために、実験毎に注入されるべきである。 ゼブラフィッシュ幼虫におけるプライマリERMS 5.スクリーニング 10〜30日には、外部から見える主要ERMSの出現のための注射後から注入されたゼブラフィッシュを守ってください。 30日間の注射後に、蓋の動きが遅いと、魚がまだまで魚システムの水を含むペトリ皿にトリカインメタン（MS222 4 mg / mlのストック溶液）の単一の液滴を添加することにより、受信者のゼブラフィッシュを麻酔。 注：トリカイン麻酔の投与量は、受信者のゼブラフィッシュの年齢とサイズに依存します。原発腫瘍を持つゼブラフィッシュトリカインの低用量を必要とする。 主要ERMS-ベアリングを選択落射蛍光顕微鏡を用いて、陽性とmylpfa-mCherryを陽性Myf5の-GFPである魚。 6. ERMS腫瘍の準備 10分間または全く蓋の動きが明らかにされなくなるまで1.6 mg / mlのトリカインメタン（MS222）で選択された一次ERMS·ベアリング·ゼブラフィッシュを生け贄に捧げる。 個別に各担癌ゼブラフィッシュを処理します。きれいなペトリ皿に魚を置き、カミソリの刃と細かい鉗子（ 図1Bに示すように）を使用して、腫瘍の周りに解剖する。きれいなペトリ皿に解剖し、腫瘍組織を転送します。 5％ウシ胎児血清（FBS）を補充した予備冷却0.9Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の100μlのを追加。 > 20回クリーンなかみそりの刃でミン​​チ組織の細胞は均一な懸濁液になるまで。 ピペットチップフィルター1000μlのを用いて細胞を解離するには、上下に数回、同じ緩衝液900μlの（0.9X PBS + 5％FBS）、ピペットを追加します。 40＆を通じてフィルター＃956;対応する50ミリリットルコニカルチューブにMメッシュストレーナー。氷の上に保管してください。 バッファの追加の2〜4ミリリットルでペトリ皿を洗って、そして同じメッシュストレーナーを通って、対応するコニカルチューブに渡す。 4℃で10分間1000×gで、少なくとも遠心分離機。 バッファー100μlの上清と再懸濁を捨てる。 トリパンブルー色素と血球計数器を用いて生存細胞の総数をカウントします。 同じ緩衝液で所望の濃度に細胞を希釈する（0.9X PBS + 5％FBS）。細胞は、レシピエントあたり2.5×10 4細胞の合計で、受信者のゼブラフィッシュあたり5μLを移植するために/μlの5×10 3個の細胞に希釈してください。 フローサイトメトリー分析は、サンプル内の蛍光細胞の相対比率を量子化するステップ6.5からの懸濁液の少量を行うことができる。 注：（ステップ3.5におけるフィルタリング以下）脇に100μlの細胞懸濁液を設定し、400μlの希釈するフローサイトメトリー分析のための0.9X PBS + 5％FBSの懸濁バッファーの。適切なゲーティングを確保するために、大人の野生型、Myf5の-GFPとmylpfa-mCherryを魚から分離され、単一のトランスジェニック腫瘍組織や筋肉を使用して追加の分析を行う。第1のステップ2で説明したように、基本的にフローサイトメトリーを実行します。 アダルトRAG2ホモ接合変異体ゼブラフィッシュへのERMSの7.移植に描画し、70％エタノール（5回）、続いて10％の漂白剤溶液（5回）、放出によって10μlの26S Gマイクロシリンジを清掃し、その後、懸濁緩衝液、続いて（0.9X PBS + 5％FBS、10倍）。 蓋の動きが遅く、魚がまだあるまで、システムの水に魚を含むペトリ皿にトリカインメタン（MS222 4 mg / mlのストック溶液）の単一の液滴を添加することにより、受信者ホモ接合RAG2変異魚を麻酔。 湿ったペーパータオルまたはSPOに麻酔をかけ、受信者のゼブラフィッシュを配置腹側を上にして、NGE。 腹腔（受信者ごとに2.5×10 4細胞）に細胞懸濁液の5μLを注入。 注：ステップ4.1で説明したように注射針が異なる腫瘍の注射の間にクリーニングする必要があります。 5〜10μlを効率的にレシピエント魚のサイズに応じて、腹腔内に移植することができる。腫瘍移植は、レシピエント魚あたり1×10 4〜5×10 5個のソートされていない細胞（ 表1）を注入することによって達成することができる。 慎重にプラスチックのスプーンできれいなタンクに受信者のゼブラフィッシュを置く。 明視野および落射蛍光顕微鏡下で麻酔をかけた魚を撮影して、移植後30日間、10、20で生着率の受信者ゼブラフィッシュを評価する。 分化状態（ 図3H）、標準的な組織学的ANALYを評価するために、蛍光活性化細胞選別（FACS）を含む下流のアプリケーションに移植された魚を活用sisの（ 図3F）、撮像治療応答15、および/ ​​または希釈分析11を制限するなどの連続移植アプローチ。